- •Научные консультанты:
- •Сокращения и глоссарий
- •Введение
- •Обзор литературы
- •1.1 Торможение в гиппокампе
- •1.1.1 ГамКергическая синаптическая передача
- •1.1.2 ГамКергические рецепторы
- •1.1.3 Разнообразие форм торможения
- •1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического торможения
- •1.2 Взаимодействие между глутамат и гамКергической системами
- •1.2.1 Гетеросинаптические взаимодействия
- •1.2.2 Критерии гетеросинаптической депрессии
- •1.2.3 Метаботропные рецепторы группы III в гиппокампе
- •1.2.4 Каинатные рецепторы в гиппокампе
- •1.3 Механизмы фокального эпилептогенеза
- •1.3.1 Исследования эпилептогенеза
- •1.3.2 Критерии развития эпилептиформной активности
- •1.3.3 Возбуждающие механизмы в эпилептогенезе
- •1.3.4 Тормозные механизмы в эпилептогенезе
- •1.4 Постановка цели и задач исследования
- •2. Материалы и методы
- •2.1 Срезы гиппокампа
- •2.1.1 Приготовление и растворы
- •2.1.2 Рабочая установка для поддержания срезов и манипуляторы
- •2.1.3 Идентификация клеток с помощью световой микроскопии
- •2.2 Регистрация и анализ полевых потенциалов
- •2.3 Записи и анализ токов (потенциалов) в режиме фиксации потенциала (тока) с одиночных нейронов
- •2.3.1 Электроды и внутриклеточные растворы
- •2.3.2 Проведение регистраций и сохранение данных
- •2.3.2 Анализ спонтанных и вызванных ответов в режиме фиксации потенциала
- •2.4 Записи и анализ ответов на ионтофоретические аппликации
- •2.5 Записи и анализ токов с outside-out patch
- •2.5.1 Приготовление outside-out patch
- •2.5.2 Система быстрой аппликации веществ
- •2.5.3 Определение биофизических свойств рецепторов с использованием анализа токов, полученных с outside-out пейчей
- •2.6 Модели эпилептогенеза in vivo
- •2.6.1 Электрический киндлинг
- •2.6.2 Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный киндлинг
- •2.7 Использованные вещества
- •2.8 Статистический анализ
- •3 Результаты исследованИй и их обсуждение
- •3.1 Нетипичные фармакологические свойства гамКергических рецепторов в гиппокампальных интернейронах
- •3.1.1 Различная чувствительность ионотропных гамКергических рецепторов к пикротоксину в интернейронах и пирамидных клетках
- •3.1.2 Ионные каналы ионотропных гамКергических рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках имеют различную проводимость
- •3.1.3 Ионотропные гамКергические рецепторы как в интернейронах, так и пирамидных клетках чувствительны к агонисту гамкс рецепторов
- •3.1.4 Пентобарбитал по-разному модулирует гамКергические токи, вызываемые аппликацией caca (50 м)
- •3.1.5 Тпст в интернейронах, регистрируемые в присутствии 100 м пикротоксина, обладают повышенной чувствительностью к антагонисту гамкс рецепторов
- •3.1.6 Токи, опосредованные гамКергическими рецепторами, в присутствии 100 м пикротоксина возникают за счет характерной Cl-/hco3- ионой проводимости
- •3.1.7 Эффект аллостерических модуляторов гамка рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.8 Сравнение эффективности антагонистов гамка и гамкс рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.9 Интернейроны содержат рецепторы, обладающие нетипичными фармакологическими свойствами
- •3.1.10 Нетипичные гамКергические рецепторы и традиционные типы рецепторов (гамка и гамкс)
- •3.1.11 Возможная субъединичная композиция нетипичных гамКергических рецепторов в интернейронах
- •Заключение
- •3.2 Регуляция возбудимости нейронов гиппокампа за счет гамКергического тонического торможения
- •3.2.1 Базовый тонический гамКергический ток специфичен для интернейронов, но не пирамидных клеток
- •3.2.2 Увеличение внеклеточной концентрации гамк ведет к возникновению тонического тока в пирамидных клетках и повышению в интернейронах
- •3.2.3 Температурная зависимость тонического гамКергического тока и фазических спонтанных тпст
- •3.2.4 Возможная роль тонического торможения в эпилептогенезе
- •3.2.5 Заключение
- •3.3 Модуляция гамКергической передачи в гиппокампе метаботропными рецепторами
- •3.3.1 L-ap4 подавляет и тормозные, и возбуждающие синаптические токи в интернейронах
- •Демонстрирующих отсутствие метаботропных рецепторов группы III на терминалях коллатералей Шаффера, оканчивающихся на пирамидных клетках са1.
- •3.3.2 Синаптически высвобождаемый глутамат снижает тпст
- •3.3.3 Глутамат опосредует гетеросинаптическую депрессию тпст
- •3.3.4 Изменения в эффективности обратного захвата глутамата влияет на гетеросинаптическую депрессию
- •3.3.5 Метаботропные рецепторы группы III опосредуют гетеросинаптическую депрессию по двум различным механизмам
- •3.3.6 Метаботропные рецепторы группы III модулируют частоту спонтанных тпст
- •3.3.7 Возможные молекулярные механизмы депрессии тпст при активации mGluR группы III
- •3.3.8 Последствия активации mGluR группы III для общей возбудимости нейрональной сети поля са1
- •3.3.9 Гетеросинаптическая депрессия, опосредованная метаботропными гамкb рецепторами
- •3.3.10 Заключение
- •3.4 Каинатные рецепторы модулируют гамКергическое торможение в гиппокампальных интернейронах
- •3.4.1 Каинат увеличивает частоту и амплитуду спонтанных тпст в интернейронах
- •3.4.2 Каинат увеличивает вероятность генерации антидромных потенциалов действия в интернейронах
- •3.4.3 Каинат вызывает спонтанные аксональные потенциалы действия
- •3.4.4 Спилловер глутамата активирует аксональные каинатные рецепторы
- •3.4.5 Последствия аксональной деполяризации, вызываемой каинатными рецепторами, для гамКергической передачи
- •3.4.6 Каинат усиливает вызванные тпст в интернейронах
- •3.4.7 Каинат приводит к увеличению гамКергического тонического тока
- •3.4.8 Последствия усиления гамКергической передачи в интернейронах, вызываемой каинатными рецепторами, для возбудимости нейрональной сети
- •3.4.9 Заключение
- •3.5 Оказывают ли метаботропные рецепторы группы III и каинатные рецепторы противоположное действие на гамКергическую передачу?
- •3.6 Механизмы развития пачечной активности в гиппокампе
- •3.6.1 Кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия создают долговременное снижение порога развития пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа
- •3.6.2 Развитие пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа не зависит от активности нейронов поля са3
- •3.6.3 Окклюзия развития пачечных разрядов в поле са1 в ответ на кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия в моделях эпилептогенеза in vivo
- •3.6.4 Является ли пачечная активность в поле са1 гиппокампа эпилептиформной?
- •3.6.5 Способность пирамидных нейронов поля са1 генерировать пачечные разряды сопровождается повышением возбудимости этих клеток
- •3.6.6 Роль nmda рецепторов и l-типа кальциевых каналов в повышение возбудимости пирамидных клеток и генерации пачечных разрядов
- •3.6.7 Заключение
- •Заключение
- •Клеткоспецифичность гамКергического торможения в гиппокампе
- •Клеткоспецифичность модуляции гамКергического торможения в гиппокампе
- •Возбудимость и торможение в эпилептогенезе
- •Эффектов веществ влияющих на гамКергические механизмы, описанные в данной диссертационной работе, представлена втаблице 4.1 (см также Рис. 4.1). Выводы
- •Список рисунков
- •Список литературы
3.2.2 Увеличение внеклеточной концентрации гамк ведет к возникновению тонического тока в пирамидных клетках и повышению в интернейронах
Предыдущие эксперименты были проведены в условиях, когда внеклеточная концентрация ГАМК поддерживалась на относительно низком уровне за счет ее обратного захвата (uptake). Однако, в определенных условиях, в частности при эпилептогенезе, внеклеточная концентрация ГАМК может значительно повышаться (Cleton et al. 2000). Исходя из этого, мы проверили, будет ли изменяться ГАМКергический тонический ток в интернейронах при повышении внеклеточной концентрации ГАМК. Если этот тонический ток специфичен только для интернейронов, то повышение внеклеточной ГАМК при блокировании ее обратного захвата должно снижать возбудимость этих клеток и, как следствие, приводить к снижению торможения пирамидных клеток.
Для подавления uptakeГАМК мы использовалиNO711 (20 µМ), специфический блокатор транспортеров этого нейропередатчика. Аппликация этого вещества вызвала значительное увеличение тока компенсации как в интернейронах, так и в пирамидных клетках (Рис. 3.2.4). Этот неожиданный результат можно объяснить по-разному. Во-первых, возможно, что ионотропные ГАМКергические рецепторы в интернейронах обладают более высокой аффинностью к ГАМК, чем ионотропные ГАМКергические рецепторы в пирамидных клетках. Во-вторых, возможно, существует два типа ионотропных ГАМКергических рецепторов, опосредующих тонический ток. Одни находятся только в интернейронах и активны при нормальных условиях, другие есть как в интернейронах, так и в пирамидных клетках и активируются при повышении внеклеточной ГАМК.
Для ответа на этот вопрос мы проверили эффект 0,5 µМ SR95531 и 100 µМ пикротоксина на увеличение тока компенсации, вызванноеNO711.SR95531 полностью подавлял увеличение тока компенсации в интернейронах, связанное с блокадой транспортеров ГАМК (Рис. 3.2.4а). Последующая аппликация пикротоксина приводила к дальнейшему снижению тока компенсации до уровня сравнимого с эффектом пикротоксина в отсутствиеNO711. В пирамидных клетках последовательная аппликация 0,5 µМSR95531 и 100 µМ пикротоксина также подавляла тонический ток вызванныйNO711. Однако, снижения тока компенсации ниже его базового уровня не происходило (Рис. 3.2.4б).
Рис. 3.2.4 Увеличение внеклеточной концентрации ГАМК приводит к тоническому току и в интернейронах, и в пирамидных клетках
NO711 блокатор обратного захвата (uptake) ГАМК вызывает увеличение тока компенсации как в интернейронах (121 ± 6 % от тока регистрируемого до аппликацииNO711;n=5;p=0,03;а), так и в пирамидных клетках (141 ± 7 %;n=4;p=0,01;б).а, Увеличение тока компенсации, вызываемоеNO711, в интернейронах полностью подавляется аппликацией 0,5 µМSR95531 (96 ± 7 % от тока доNO711;n=5;p=0,64 –t-тест между током доNO711 и током в присутствииNO711 иSR95531). Последующее добавление 100 µМ пикротоксина приводит к дальнейшему снижению тока компенсации (71 ± 8 % от тока регистрируемого до аппликацииNO711;n=5;p=0,02).б, Последовательная аппликацияSR95531 и пикротоксина подавляет повышение тока компенсации в пирамидных клетках, вызванноеNO711, (ток компенсации в присутствии обоих антагонистов был 90 ± 10 % от тока регистрируемого до аппликацииNO711;n=4;p=0,32 -t-тест между током доNO711 и током в присутствииNO711,SR95531 и пикротоксина).
Полученные данные свидетельствуют в пользу наличия двух форм ГАМКергической тонической проводимости в интернейронах str.radiatumполя СА1 гиппокампа. Одна, характерная также для пирамидных клеток, появляется при повышении внеклеточной концентрации ГАМК. Другая, независимая от повышения внеклеточной концентрации агониста, обнаруживается только в интернейронах. Возможно, что базовый тонический ток в интернейронах опосредован ГАМКергическими рецепторами, которые максимально активированы при нормальной концентрации ГАМК. С другой стороны, можно предположить, что ионные каналы этих рецепторов могут спонтанно открываться вне зависимости от связывания агониста (Birnir et al. 2000b).