2.1.3 Идентификация клеток с помощью световой микроскопии

Для морфологического анализа и поиска определенного типа клеток использовался микроскоп с системой проходящего через объект света (Axioskop FS, Zeiss, Германия), оснащенный оптикой с дифференционным интерференционным контрастом (DIC) в инфракрасном свете (IR-DIC). Свет от источника, галогеновой лампы фирмыPhilips(Германия) марки 250-429, отцентровывался и фокусировался перед началом каждого эксперимента. Проверка и, при необходимости, настройка системы дифференционного интерференционного контраста проводилась приблизительно раз в 2 месяца. Для наведения на область среза гиппокампа использовался объектив 10X, затем он переключался на водно-иммерсионный объектив 40X. При использовании последнего объектива устанавливались стимулирующий(ие) и регистрирующий электроды. Для большего увеличения изображения на мониторе использовалась приставка к видеокамере с набором линз 1X, 2X, 4X. Все операции проводились при наблюдении сигнала от микроскопа, отводимого видеокамеройHamamatsu(Япония), на экране монитораPanasonicWV-5410 (Япония). Для создания иллюстраций использовался

Рис. 2.2 Область СА1 гиппокампа и типы клеток, с которых производилась запись

а, Схема среза гиппокампа с указанием областей (СА1, СА3 и ЗФ – зубчатая фасция). Рамкой показана область гиппокампа, с которой обычно проводились записи. Цифровая фотография получена с помощью камеры Hamamatsu (Япония). На ней обозначены слои поля СА1 гиппокампа – str. radiatum и str. pyramidale. Шкала 40 µм.б, фотографии типичных интернейронов str. radiatum, с которых производились записи. Шкала 20 µм.в, Фотографии пирамидных нейронов str. pyramidale. Шкала 20 µм.

видео-цифровой преобразователь IMAQ PCI-1408 (National Instruments, США). Характерные фотографии препарата и отдельных типов клеток показаны на рисунке 2.2.

В представленной диссертационной работе использовались два типа клеток: интернейроны str.radiatumи пирамидные клеткиstr.pyramidaleполя СА1. Из исследования исключались крупные интернейроны имеющие пирамидную форму, поскольку они могли оказаться пирамидными клетками, смещенными из str.pyramidale. При использованной оптической системе интернейроны можно было подразделить на би-, три- и мультиполярные по системе отходящих дендритов. Пирамидные клетки идентифицировались по их расположению в поле str.pyramidale и характерной вытянутой пирамидной форме. Помимо морфологических параметров для идентификации клеток использовались электрические параметры, такие как входное сопротивление клеток (более низкое в интернейронах), мембранный потенциал и характеристики спонтанных потенциалов действия. Потенциал покоя мембраны был выше в пирамидных клетках (60-70 мВ), чем в интернейронах (55-65 мВ). Интересно, что самый высокий потенциал покоя наблюдался в астроцитах (около 80 мВ). Это и отсутствие спонтанной и вызванной синаптической активности позволяло отличать их от мелких интернейронов.

Записи не производились с клеток, в которых четко обозначалось ядро или содержимое цитоплазмы выглядело гранулированным, что могло быть признаками некроза или апоптоза. Как правило, в таких клетках не удается получить конфигурацию whole cell, но даже если она получается, записи электрической активности не стабильны, мембранный потенциал крайне низок, а регистрации не превышают 20 минут (тогда как в нормальных условиях составляют 2-3 часа).