- •Научные консультанты:
- •Сокращения и глоссарий
- •Введение
- •Обзор литературы
- •1.1 Торможение в гиппокампе
- •1.1.1 ГамКергическая синаптическая передача
- •1.1.2 ГамКергические рецепторы
- •1.1.3 Разнообразие форм торможения
- •1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического торможения
- •1.2 Взаимодействие между глутамат и гамКергической системами
- •1.2.1 Гетеросинаптические взаимодействия
- •1.2.2 Критерии гетеросинаптической депрессии
- •1.2.3 Метаботропные рецепторы группы III в гиппокампе
- •1.2.4 Каинатные рецепторы в гиппокампе
- •1.3 Механизмы фокального эпилептогенеза
- •1.3.1 Исследования эпилептогенеза
- •1.3.2 Критерии развития эпилептиформной активности
- •1.3.3 Возбуждающие механизмы в эпилептогенезе
- •1.3.4 Тормозные механизмы в эпилептогенезе
- •1.4 Постановка цели и задач исследования
- •2. Материалы и методы
- •2.1 Срезы гиппокампа
- •2.1.1 Приготовление и растворы
- •2.1.2 Рабочая установка для поддержания срезов и манипуляторы
- •2.1.3 Идентификация клеток с помощью световой микроскопии
- •2.2 Регистрация и анализ полевых потенциалов
- •2.3 Записи и анализ токов (потенциалов) в режиме фиксации потенциала (тока) с одиночных нейронов
- •2.3.1 Электроды и внутриклеточные растворы
- •2.3.2 Проведение регистраций и сохранение данных
- •2.3.2 Анализ спонтанных и вызванных ответов в режиме фиксации потенциала
- •2.4 Записи и анализ ответов на ионтофоретические аппликации
- •2.5 Записи и анализ токов с outside-out patch
- •2.5.1 Приготовление outside-out patch
- •2.5.2 Система быстрой аппликации веществ
- •2.5.3 Определение биофизических свойств рецепторов с использованием анализа токов, полученных с outside-out пейчей
- •2.6 Модели эпилептогенеза in vivo
- •2.6.1 Электрический киндлинг
- •2.6.2 Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный киндлинг
- •2.7 Использованные вещества
- •2.8 Статистический анализ
- •3 Результаты исследованИй и их обсуждение
- •3.1 Нетипичные фармакологические свойства гамКергических рецепторов в гиппокампальных интернейронах
- •3.1.1 Различная чувствительность ионотропных гамКергических рецепторов к пикротоксину в интернейронах и пирамидных клетках
- •3.1.2 Ионные каналы ионотропных гамКергических рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках имеют различную проводимость
- •3.1.3 Ионотропные гамКергические рецепторы как в интернейронах, так и пирамидных клетках чувствительны к агонисту гамкс рецепторов
- •3.1.4 Пентобарбитал по-разному модулирует гамКергические токи, вызываемые аппликацией caca (50 м)
- •3.1.5 Тпст в интернейронах, регистрируемые в присутствии 100 м пикротоксина, обладают повышенной чувствительностью к антагонисту гамкс рецепторов
- •3.1.6 Токи, опосредованные гамКергическими рецепторами, в присутствии 100 м пикротоксина возникают за счет характерной Cl-/hco3- ионой проводимости
- •3.1.7 Эффект аллостерических модуляторов гамка рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.8 Сравнение эффективности антагонистов гамка и гамкс рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.9 Интернейроны содержат рецепторы, обладающие нетипичными фармакологическими свойствами
- •3.1.10 Нетипичные гамКергические рецепторы и традиционные типы рецепторов (гамка и гамкс)
- •3.1.11 Возможная субъединичная композиция нетипичных гамКергических рецепторов в интернейронах
- •Заключение
- •3.2 Регуляция возбудимости нейронов гиппокампа за счет гамКергического тонического торможения
- •3.2.1 Базовый тонический гамКергический ток специфичен для интернейронов, но не пирамидных клеток
- •3.2.2 Увеличение внеклеточной концентрации гамк ведет к возникновению тонического тока в пирамидных клетках и повышению в интернейронах
- •3.2.3 Температурная зависимость тонического гамКергического тока и фазических спонтанных тпст
- •3.2.4 Возможная роль тонического торможения в эпилептогенезе
- •3.2.5 Заключение
- •3.3 Модуляция гамКергической передачи в гиппокампе метаботропными рецепторами
- •3.3.1 L-ap4 подавляет и тормозные, и возбуждающие синаптические токи в интернейронах
- •Демонстрирующих отсутствие метаботропных рецепторов группы III на терминалях коллатералей Шаффера, оканчивающихся на пирамидных клетках са1.
- •3.3.2 Синаптически высвобождаемый глутамат снижает тпст
- •3.3.3 Глутамат опосредует гетеросинаптическую депрессию тпст
- •3.3.4 Изменения в эффективности обратного захвата глутамата влияет на гетеросинаптическую депрессию
- •3.3.5 Метаботропные рецепторы группы III опосредуют гетеросинаптическую депрессию по двум различным механизмам
- •3.3.6 Метаботропные рецепторы группы III модулируют частоту спонтанных тпст
- •3.3.7 Возможные молекулярные механизмы депрессии тпст при активации mGluR группы III
- •3.3.8 Последствия активации mGluR группы III для общей возбудимости нейрональной сети поля са1
- •3.3.9 Гетеросинаптическая депрессия, опосредованная метаботропными гамкb рецепторами
- •3.3.10 Заключение
- •3.4 Каинатные рецепторы модулируют гамКергическое торможение в гиппокампальных интернейронах
- •3.4.1 Каинат увеличивает частоту и амплитуду спонтанных тпст в интернейронах
- •3.4.2 Каинат увеличивает вероятность генерации антидромных потенциалов действия в интернейронах
- •3.4.3 Каинат вызывает спонтанные аксональные потенциалы действия
- •3.4.4 Спилловер глутамата активирует аксональные каинатные рецепторы
- •3.4.5 Последствия аксональной деполяризации, вызываемой каинатными рецепторами, для гамКергической передачи
- •3.4.6 Каинат усиливает вызванные тпст в интернейронах
- •3.4.7 Каинат приводит к увеличению гамКергического тонического тока
- •3.4.8 Последствия усиления гамКергической передачи в интернейронах, вызываемой каинатными рецепторами, для возбудимости нейрональной сети
- •3.4.9 Заключение
- •3.5 Оказывают ли метаботропные рецепторы группы III и каинатные рецепторы противоположное действие на гамКергическую передачу?
- •3.6 Механизмы развития пачечной активности в гиппокампе
- •3.6.1 Кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия создают долговременное снижение порога развития пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа
- •3.6.2 Развитие пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа не зависит от активности нейронов поля са3
- •3.6.3 Окклюзия развития пачечных разрядов в поле са1 в ответ на кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия в моделях эпилептогенеза in vivo
- •3.6.4 Является ли пачечная активность в поле са1 гиппокампа эпилептиформной?
- •3.6.5 Способность пирамидных нейронов поля са1 генерировать пачечные разряды сопровождается повышением возбудимости этих клеток
- •3.6.6 Роль nmda рецепторов и l-типа кальциевых каналов в повышение возбудимости пирамидных клеток и генерации пачечных разрядов
- •3.6.7 Заключение
- •Заключение
- •Клеткоспецифичность гамКергического торможения в гиппокампе
- •Клеткоспецифичность модуляции гамКергического торможения в гиппокампе
- •Возбудимость и торможение в эпилептогенезе
- •Эффектов веществ влияющих на гамКергические механизмы, описанные в данной диссертационной работе, представлена втаблице 4.1 (см также Рис. 4.1). Выводы
- •Список рисунков
- •Список литературы
2.6.2 Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный киндлинг
В работе были использованы крысы линии Крушинского-Молодкиной (КМ), генетически предрасположенных к аудиогенной судорожной активности. Они были разделены на две группы. Первая группа это крысы, не подвергавшиеся звуковому воздействию (n=10). Вторая - крысы, которым давались периодические кратковременные (до 90 сек.) предъявления звукового стимула (1 раз в день) в течение 40 дней (аудиогенный киндлинг) (n=4).
В опытах с хронической звуковой стимуляцией использовались самцы крыс линии КМ массой 200-250 граммов, которые содержались в условиях вивария при постоянных температурных условиях и продолжительности светового периода 12 часов. Предварительно, животные тестировались по продолжительности и интенсивности аудиогенной судорожной реакции в ответ на действие звука (115 дБ, 12-16 кГц, 90 сек.) по 4-х бальной шкале (Батуев и др., 1997).
1 балл - двигательное возбуждение, бег, прыжки
2 балла - двигательное возбуждение заканчивается внезапным ступорозным состоянием с падением животного на брюшко.
3 балла – 2 балла + падение животного на бок с резкими клоническими судорогами.
4 балла – 3 балла + тоническое напряжение всей мускулатуры и временная остановка дыхания.
Хроническая стимуляция, проводимая в течение 21 дня звуковыми стимулами интенсивностью 75 дБ до начала двигательного возбуждения (но не более 90 секунд), приводила к постепенному увеличению продолжительности и интенсивности аудиогенной судорожной реакции от реакции в 2,5 ± 0,4 бала с латентным периодом 5-7 сек. к реакции в 3,5 ± 0,6 балла с латентным периодом 2-5 сек., включающей миоклонические гиперкинезы. Дальнейшее продолжение ежедневной стимуляции до 40 дней усиливало выраженность этих реакций. Использование более длительной стимуляции не приводило к дальнейшим изменениям. Поэтому через 40 дней звуковые стимулы прекращались. Полученное состояние сохранялось, по крайней мере, в течение одной недели без предъявления звука. После этого животных декапитировали и выделяли срезы гиппокампа для последующего анализа.
2.7 Использованные вещества
Вещества для приготовления рабочих растворов были приобретены в фирме Sigma (Dorset, Великобритания), специфические агонисты, антагонисты и модуляторы рецепторов в Tocris Cookson LTD (Bristol, Великобритания), QX314Br вTCSBiologycals(Buckinghamshire, Великобритания), тетродотоксин вLatoxan(Valence, Франция). Рабочий раствор Рингера и раствор для резки срезов готовился на основе бидистиллированной или деионизованной воды перед каждым экспериментом из маточного раствора, содержащего все компоненты кроме глюкозы иCaCl2, которые добавлялись в последнюю очередь. Агонисты и антагонисты готовились в объеме необходимом для проведения нескольких экспериментов и замораживались в эппендорфах. В качестве растворителя использовалась деионизированная вода,DMSOили эквимолярная концентрация NaOH (NaOH э.м.). В качестве маточного раствора пентобарбитала использовался раствор, применяемый при эфтаназии (60 мг/мл). Раствор тетродотоксина готовился при введении с помощью шприца в запаянный флакон растворителя (слабого раствора уксусной кислоты) в необходимом объеме. Использованные в работе вещества и их концентрации приведены в таблице 2.1
Таблица 2.1 Использованные вещества
|
Вещество |
Эффект |
Концентр. |
Раствори- тель |
Мол. масса |
Примечание |
|
(-)-бикукуллина метобромид |
Антагонист ГАМКА рецепторов |
10 μМ |
вода |
471.31 |
Возможны эффекты не только на ГАМК рецепторы |
|
CACA |
Агонист ГАМКС рецепторов |
200 мM |
вода |
101.11 |
Ионтофорез (агонист растворялся в физ. растворе) |
|
CGP 52432 |
ГАМКB антагонист |
5 μМ |
вода |
420 |
|
|
CNQX |
Антагонист каинатных и AMPA рецепторов |
50 μМ |
вода |
307.64 |
Может дествовать на NMDA рецепторы |
|
Дегидрокаинат (DHK) |
Блокатор uptake глутамата |
200 μМ |
NaOH э.м. |
|
|
|
DL-APV |
Антагонист NMDA рецепторов |
50 μМ |
NaOH э.м. |
197 |
|
|
ГАМК |
Агонист ГАМК рецепторов |
200 мМ |
вода |
103.12 |
Ионтофорез (агонист растворялся в физ. растворе) |
|
GYKI 53655 |
Антагонист AMPA рецепторов |
50 μМ |
DMSO |
361.4 |
|
|
Изокувазина гидрохлорид |
Специфический агонист ГАМКА рецепторов |
100 мМ |
вода |
163.6 |
Ионтофорез (агонист растворялся в физ. растворе) |
|
каинат |
Агонист каинатных и AMPA рецепторов |
250 нМ, 1 μМ |
NaOH э.м. |
235.75 |
Может влиять на uptake гутамата |
|
L-AP4*H2O |
Агонист mGluRIII |
50 μМ |
NaOH э.м. |
201 |
|
|
MSOP*21/4 H2O |
Антагонист mGluRIII |
100 μМ |
NaOH э.м. |
240 |
|
|
NBQX*H2O |
Антагонист каинатных и AMPA рецепторов |
25 μМ |
вода |
398 |
|
|
Пентобарбитал |
Модулятор ГАМК рецепторов |
100 μМ |
готовый раствор |
226.3 |
Разведение готового растворя для инъекций 60 мг/мл |
|
Пикротоксин (PTX) |
Антагонист ГАМК рецепторов |
0,1 - 1000 μМ |
DMSO |
602.6 |
Смесь 1:1 пикротоксинина и пикротина |
|
SCH 50911 |
Антагонист ГАМКB |
20 μМ |
вода |
175.01 |
|
|
SKF 89976A |
Блокатор uptake ГАМК |
25 μМ |
вода |
371.9 |
Основной эффект на GAT1 - транспортер |
|
SR 95531 (габазин) |
Специфический Антагонист ГАМКА |
10 μМ |
вода |
368.23 |
|
|
TACA |
Агонист ионотропных ГАМК рецепторов |
2,5 – 15 μМ |
вода |
101.11 |
|
|
THA |
Блокатор uptake глутамата |
300 μМ |
NaOH э.м. |
|
|
|
TPMPA |
Антагонист ГАМКС рецепторов |
200 μМ |
вода |
161.14 |
При высоких конц. блокирует и ГАМКА |
|
Тетродотоксин (TTX) |
Блокатор Na+-каналов |
2 μМ |
раствор ацетата |
319.28 |
Крайне токсичен |