2.3.2 Проведение регистраций и сохранение данных

Заполненный соответствующим раствором пейч-кламповский электрод при поданном на него небольшом позитивном давлении вводился под объектив микроскопа, расположенный над заранее морфологически идентифицированной клеткой. При этом сопротивление электрода измерялась по ступеньке негативного сдвига потенциала, которая регистрировалась как ток прямоугольной формы. При приближении к клетке величина этого стока снижалась, что указывало на повышение сопротивления. В этот момент позитивное давление в электроде снималось и заменялось небольшим негативным, что приводило к формированию плотного контакта кончика электрода и внеклеточной мембраны клетки (cellattachedmode). При этом ступенька тока практически полностью исчезала, что свидетельствовало о дальнейшем повышении сопротивления и формировании гигаомного контакта (гигасила). Затем использовались кратковременные и частые негативные увеличения давления в электроде, для того чтобы прорвать клеточную мембрану под ним. Когда это происходило, снова появлялся ток в ответ на прямоугольный сдвиг потенциала (Рис. 2.4в₃). Этот ток отражал сопротивление электрода, цитоплазмы и мембраны клетки (входное сопротивление –inputresistance). В таком режиме (whole cell mode) и проводились дальнейшие исследования. Электрическая стимуляция приводила к регистрации постсинаптических токов (Рис. 2.4 в₁) или потенциалов в режиме фиксации потенциала или тока, соответственно. Кроме того, регистрировались ответы и на спонтанный выброс медиатора – спонтанные тормозные (ТПСТ) или возбуждающие (ВПСТ) постсинаптические токи (Рис. 2.4 в₂). Они, как правило, были значительно меньше по амплитуде вызванных токов и являлись свидетельством здорового состояния ткани.

Если использовался метод фиксации потенциала, то клетка поддерживалась при различных потенциалах в зависимости от задачи (см. главу 3. Результаты исследований и их обсуждение), однако, в большинстве экспериментов при -60 мВ. В этом случае, если собственный потенциал клетки (при использованных внеклеточном и внутриклеточном растворах) был равен -60 мВ, то усилитель не подавал никакого тока для фиксации этого потенциала. Как только потенциал клетки изменялся, то усилитель его компенсировал с помощью соответствующего тока (ток компенсации). Изменения тока компенсации были использованы для исследования медленных процессов в клетке, таких как тоническое ГАМКергическое торможение.

В работе были использованы усилители Axoclamp2Bи Axopatch 1D (Axon Instruments, Union City, Калифорния, США). Записываемый сигнал фильтровался на частоте 1 кГц, затем оцифровывался при частоте 2 кГц и сохранялся в персональном компьютере. Для записи данных использовались программы, созданные в системеLabView5.0.

2.3.2 Анализ спонтанных и вызванных ответов в режиме фиксации потенциала

Данные, полученные в ходе экспериментов и сохраненные на жестком диске, предварительно анализировались с использованием программ, написанных в LabView5.0, а также с помощью программыKPLAnalyser(авторDr.Knit-PitterLehre).

Предварительный анализ

Предварительный анализ включал в себя оценку четырех основных параметров. Во-первых, измерялась амплитуда вызванных синаптических токов (Рис. 2.4 в₁), константа их затухания (τ_{затухания}исходя из моноэкспоненциальной аппроксимации затухания тока) и площадь под пиком (имеющая смысл переносимого заряда). Во-вторых, идентифицировались спонтанные синаптические токи, для которых получали частоту, среднюю амплитуду и τ_{затухания}для каждой отдельной регистрации (Рис. 2.4 в₂). Затем рассчитывался средний ток, переносимый спонтанными ТПСТ в каждой регистрации (частота спонтанных ТПСТ умноженная на заряд, переносимый средним ТПСТ). В случае, если задачей ставилось изучение спонтанных ТПСТ, ВПСТ или токов действия, длительность каждой регистрации была не меньше 5 секунд. Это позволяло помимо средних величин для каждой регистрации оценить паттерн спонтанной активности (регулярность-нерегулярность, генерация пачечных ответов). В-третьих, анализировалась величина тока компенсации, которая является суммарным показателем проводимости мембраны клетки и качества регистрации (контакта электрода с мембраной, целостности клетки). При стабильных условиях записи, ток компенсации был использован для оценки тонического ГАМКергического торможения. В-четвертых, оценивалось входное сопротивление клетки по анализу тока в ответ на прямоугольный гиперполяризующий сдвиг потенциала (20 мс; -5 мВ), который давался в промежутках между стимуляцией (Рис. 2.4 в₃).

Последующий анализ

Полученные в нескольких экспериментах данные усреднялись и были представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (С.О.С.). Для усреднения данных, полученных в различных клетках, ответы нормировались к их среднему значению при базовых условиях (до экспериментального воздействия) в каждом эксперименте.

Для построения ток-потенциал (I-V) зависимостей потенциал мембраны фиксировался на -80, -60, -40, -20, 0, 20, 40, 60 и 80 мВ. Амплитуда ответов нормировалась в каждом эксперименте к току, возникающему при потенциале 80 мВ.

Для оценки участия пресинаптических механизмов в эффекте экспериментального воздействия оценивался коэффициент парной стимуляции. Известно, что если нанести два стимула пресинаптических терминалей с коротким интервалом амплитуда второго ТПСТ (ВПСТ) будет отличаться от амплитуды первого. Если она меньше амплитуды первого ответа, то такой феномен называется парной депрессией, если больше, то парной фасилитацией. Эти феномены, при записи с одной клетки в режиме фиксации потенциала, частично связывают с изменением эффективности выброса медиатора пресинаптичесими терминалями. В данной работе мы использовали измерение коэффициента парной стимуляции с интервалом между стимулами 50 мс для ТПСТ в гиппокампальных интернейронах. Это проводилось для исследования пре- или постсинаптической природы модуляции высвобождения ГАМК каинатными и метаботропными рецепторами глутамата группы  III.

Другим методом оценки пре- или постсинаптической природы эффекта является анализ коэффициента вариации (CV) ТПСТ. Было показано, что статистический параметр 1/CV²меняется с квантовым составом (Edwards et al. 1989) и может быть грубой оценкой высвобождения медиатора в гиппокампальных синапсах (Manabe et al. 1993). Таким образом, если снижение амплитуды ТПСТ сопровождается пропорциональным снижением данного статистического параметра, то это будет указывать на наличие пресинаптического механизма. Рассчеты производились по формуле:, где- квадрат средней амплитуды ТПСТ,-дисперсия ТПСТ,- дисперсия шума (записи перед электрическим стимулом). Средняя амплитуда ТПСТ находилась по 20 последовательным парным стимуляциям при базовых условиях и по 20 при аппликации экспериментального вещества.

Для оценки фармакологических свойств ГАМКергических рецепторов в данной работе строились доза-эффект зависимости подавления ТПСТ пикротоксином. Для этого концентрация вещества во внеклеточном растворе последовательно увеличивалась, при этом измерялась амплитуда ТПСТ. Затем строилась зависимость амплитуды, нормированной к средней амплитуде до добавления пикротоксина, от концентрации пикротоксина (в полулогарифмических координатах). Эта зависимость аппроксимировалась соотношением Хилла: , где ТПСТ – амплитуда ТПСТ, [PTX] – концентрация пикротоксина,H– коэффициент Хилла,IC₅₀– концентрация пикротоксина, при которой амплитуда ТПСТ равняется половине от базовой.