- •Научные консультанты:
- •Сокращения и глоссарий
- •Введение
- •Обзор литературы
- •1.1 Торможение в гиппокампе
- •1.1.1 ГамКергическая синаптическая передача
- •1.1.2 ГамКергические рецепторы
- •1.1.3 Разнообразие форм торможения
- •1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического торможения
- •1.2 Взаимодействие между глутамат и гамКергической системами
- •1.2.1 Гетеросинаптические взаимодействия
- •1.2.2 Критерии гетеросинаптической депрессии
- •1.2.3 Метаботропные рецепторы группы III в гиппокампе
- •1.2.4 Каинатные рецепторы в гиппокампе
- •1.3 Механизмы фокального эпилептогенеза
- •1.3.1 Исследования эпилептогенеза
- •1.3.2 Критерии развития эпилептиформной активности
- •1.3.3 Возбуждающие механизмы в эпилептогенезе
- •1.3.4 Тормозные механизмы в эпилептогенезе
- •1.4 Постановка цели и задач исследования
- •2. Материалы и методы
- •2.1 Срезы гиппокампа
- •2.1.1 Приготовление и растворы
- •2.1.2 Рабочая установка для поддержания срезов и манипуляторы
- •2.1.3 Идентификация клеток с помощью световой микроскопии
- •2.2 Регистрация и анализ полевых потенциалов
- •2.3 Записи и анализ токов (потенциалов) в режиме фиксации потенциала (тока) с одиночных нейронов
- •2.3.1 Электроды и внутриклеточные растворы
- •2.3.2 Проведение регистраций и сохранение данных
- •2.3.2 Анализ спонтанных и вызванных ответов в режиме фиксации потенциала
- •2.4 Записи и анализ ответов на ионтофоретические аппликации
- •2.5 Записи и анализ токов с outside-out patch
- •2.5.1 Приготовление outside-out patch
- •2.5.2 Система быстрой аппликации веществ
- •2.5.3 Определение биофизических свойств рецепторов с использованием анализа токов, полученных с outside-out пейчей
- •2.6 Модели эпилептогенеза in vivo
- •2.6.1 Электрический киндлинг
- •2.6.2 Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный киндлинг
- •2.7 Использованные вещества
- •2.8 Статистический анализ
- •3 Результаты исследованИй и их обсуждение
- •3.1 Нетипичные фармакологические свойства гамКергических рецепторов в гиппокампальных интернейронах
- •3.1.1 Различная чувствительность ионотропных гамКергических рецепторов к пикротоксину в интернейронах и пирамидных клетках
- •3.1.2 Ионные каналы ионотропных гамКергических рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках имеют различную проводимость
- •3.1.3 Ионотропные гамКергические рецепторы как в интернейронах, так и пирамидных клетках чувствительны к агонисту гамкс рецепторов
- •3.1.4 Пентобарбитал по-разному модулирует гамКергические токи, вызываемые аппликацией caca (50 м)
- •3.1.5 Тпст в интернейронах, регистрируемые в присутствии 100 м пикротоксина, обладают повышенной чувствительностью к антагонисту гамкс рецепторов
- •3.1.6 Токи, опосредованные гамКергическими рецепторами, в присутствии 100 м пикротоксина возникают за счет характерной Cl-/hco3- ионой проводимости
- •3.1.7 Эффект аллостерических модуляторов гамка рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.8 Сравнение эффективности антагонистов гамка и гамкс рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.9 Интернейроны содержат рецепторы, обладающие нетипичными фармакологическими свойствами
- •3.1.10 Нетипичные гамКергические рецепторы и традиционные типы рецепторов (гамка и гамкс)
- •3.1.11 Возможная субъединичная композиция нетипичных гамКергических рецепторов в интернейронах
- •Заключение
- •3.2 Регуляция возбудимости нейронов гиппокампа за счет гамКергического тонического торможения
- •3.2.1 Базовый тонический гамКергический ток специфичен для интернейронов, но не пирамидных клеток
- •3.2.2 Увеличение внеклеточной концентрации гамк ведет к возникновению тонического тока в пирамидных клетках и повышению в интернейронах
- •3.2.3 Температурная зависимость тонического гамКергического тока и фазических спонтанных тпст
- •3.2.4 Возможная роль тонического торможения в эпилептогенезе
- •3.2.5 Заключение
- •3.3 Модуляция гамКергической передачи в гиппокампе метаботропными рецепторами
- •3.3.1 L-ap4 подавляет и тормозные, и возбуждающие синаптические токи в интернейронах
- •Демонстрирующих отсутствие метаботропных рецепторов группы III на терминалях коллатералей Шаффера, оканчивающихся на пирамидных клетках са1.
- •3.3.2 Синаптически высвобождаемый глутамат снижает тпст
- •3.3.3 Глутамат опосредует гетеросинаптическую депрессию тпст
- •3.3.4 Изменения в эффективности обратного захвата глутамата влияет на гетеросинаптическую депрессию
- •3.3.5 Метаботропные рецепторы группы III опосредуют гетеросинаптическую депрессию по двум различным механизмам
- •3.3.6 Метаботропные рецепторы группы III модулируют частоту спонтанных тпст
- •3.3.7 Возможные молекулярные механизмы депрессии тпст при активации mGluR группы III
- •3.3.8 Последствия активации mGluR группы III для общей возбудимости нейрональной сети поля са1
- •3.3.9 Гетеросинаптическая депрессия, опосредованная метаботропными гамкb рецепторами
- •3.3.10 Заключение
- •3.4 Каинатные рецепторы модулируют гамКергическое торможение в гиппокампальных интернейронах
- •3.4.1 Каинат увеличивает частоту и амплитуду спонтанных тпст в интернейронах
- •3.4.2 Каинат увеличивает вероятность генерации антидромных потенциалов действия в интернейронах
- •3.4.3 Каинат вызывает спонтанные аксональные потенциалы действия
- •3.4.4 Спилловер глутамата активирует аксональные каинатные рецепторы
- •3.4.5 Последствия аксональной деполяризации, вызываемой каинатными рецепторами, для гамКергической передачи
- •3.4.6 Каинат усиливает вызванные тпст в интернейронах
- •3.4.7 Каинат приводит к увеличению гамКергического тонического тока
- •3.4.8 Последствия усиления гамКергической передачи в интернейронах, вызываемой каинатными рецепторами, для возбудимости нейрональной сети
- •3.4.9 Заключение
- •3.5 Оказывают ли метаботропные рецепторы группы III и каинатные рецепторы противоположное действие на гамКергическую передачу?
- •3.6 Механизмы развития пачечной активности в гиппокампе
- •3.6.1 Кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия создают долговременное снижение порога развития пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа
- •3.6.2 Развитие пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа не зависит от активности нейронов поля са3
- •3.6.3 Окклюзия развития пачечных разрядов в поле са1 в ответ на кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия в моделях эпилептогенеза in vivo
- •3.6.4 Является ли пачечная активность в поле са1 гиппокампа эпилептиформной?
- •3.6.5 Способность пирамидных нейронов поля са1 генерировать пачечные разряды сопровождается повышением возбудимости этих клеток
- •3.6.6 Роль nmda рецепторов и l-типа кальциевых каналов в повышение возбудимости пирамидных клеток и генерации пачечных разрядов
- •3.6.7 Заключение
- •Заключение
- •Клеткоспецифичность гамКергического торможения в гиппокампе
- •Клеткоспецифичность модуляции гамКергического торможения в гиппокампе
- •Возбудимость и торможение в эпилептогенезе
- •Эффектов веществ влияющих на гамКергические механизмы, описанные в данной диссертационной работе, представлена втаблице 4.1 (см также Рис. 4.1). Выводы
- •Список рисунков
- •Список литературы
1.3.2 Критерии развития эпилептиформной активности
Для развития полноценной эпилептиформной активности в мозге должны выполняться три основных критерия.
Во-первых, принципиальные клетки должны разряжаться пачками потенциалов действия. Причинами такой активности могут быть различные по своей природе события. Например, потенциация глутаматергической синаптической передачи (Cain 1989; McEachern and Shaw 1996), изменения в активности постсинаптических кальциевых каналов (Coulter et al. 1989; Faas et al. 1996; Speckmann et al. 1993; Vreugdenhil and Wadman 1992), изменения в тоническом торможении клеток (Hausser and Clark 1997) (Рис. 1.3а). Однако, сама по себе способность разряжаться пачками потенциалов действия не является эпилептиформным событием, поскольку изменение паттерна активности нейронов, является принципиальным событием в обработке информации мозгом (D'Angelo et al. 2001; Twery et al. 1992).
Вторым критерием развития эпилептиформной активности является синхронизация пачечных разрядов в группе возбуждающих клеток. Данное событие, само по себе, имеет место в нормальном мозге, например, при генерации ритмов в его структурах (Suzuki and Smith 1988). Синхронизация активности нейронов может происходить благодаря организации связей между ними. Одна ситуация возникает при наличии взаимных синаптических связей между возбуждающими клетками (Bains et al. 1999; Debanne et al. 1995; Sohal et al. 2000) (Рис. 1.3б1). В этом случае генерация пачечного разряда в одной клетке приводит к возникновению синаптического деполяризационного сдвига в группе клеток и генерации в них синхронного пачечного разряда. Синхронизировать разряды нейронов может также наличие электрического взаимодействия (несинаптического типа) между их мембранами (Galarreta and Hestrin 1999) (Рис. 1.3б2). Еще одним интересным механизмом синхронизации является
Рис. 1.3 Эпилептогенные и антиэпилептогенные факторы. Механизмы синхронизации активности в группах нейронов
а, Пирамидный нейрон (ПК) генерирует пачечные разряды при формировании в нем Ca2+-опосредованных пароксизмальных деполяризационных сдвигов (ПДС) или потенциации возбуждающей глутаматергической передачи (LTP). Механизмами подавления пачечной активности являются послеспайковая гиперполяризация (ПГП) и прямое и возвратное торможение (ПиВТ). Эпилептогенные механизмы указаны красными стрелками, антиэпилептогенные – синими.
б, Механизмы синхронизации активности в группе принципиальных нейронов
б1– механизм синхронизации пачечных разрядов посредством возвратных коллатералей: возбуждающая пирамидная клетка (ПК1) образует синаптические связи с другими возбуждающими нейронами (ПК2, ПК3). При генерации пачки разрядов в ПК1, одновременно возбуждаются ПК2 и ПК3.б2- механизм синхронизации пачечных разрядов посредством электрических контактов: возбуждающая пирамидная клетка (ПК1) образует электрические контакты (эфапсы) с другой клеткой (ПК2), та в свою очередь с третьей (ПК3). Развитие пачечного разряда в ПК1, приводит к изменению потенциала мембраны так же и в ПК2,3.б3– ГАМКергический интернейрон (ИН) образует тормозные синапсы на нескольких пирамидных нейронах (ПК1, ПК2, ПК3) и одновременно их тормозит. После окончания тормозного события, происходит одновременный разряд в возбуждающих клетках, ребаунд возбуждение.
синхронизация активности возбуждающих клеток за счет тормозных интернейронов (Huguenard 1998). В областях мозга, где наличие взаимных синаптических связей между возбуждающими нейронами не четко выражено тормозные интернейроны, иннервирующие одновременно целые популяции клеток, могут оказывать синхронизирующее влияние. При активации такого интернейрона тормозятся одновременно многие клетки (Рис. 1.3б3). Когда, тормозное синаптическое событие заканчивается, существует вероятность одновременного синхронного разряда, по крайней мере, в нескольких из них. Этот феномен называется ребаунд (rebound) возбуждение. Таким образом, при эпилептогенезе возбуждающие нейроны генерируют пачки потенциалов действия, и эта активность синхронизирована в целой популяции клеток.
Однако, эпилепсия это системный феномен, вовлекающий различные структуры и функции мозга. Поэтому, третьим критерием эпилептогенеза является распространения эпилептиформной активности в мозге. В нормальной ситуации, такого распространения не должно происходить, поскольку система возбуждающих, тормозных и модулирующих связей эффективно регулирует возбудимость. Однако, если принять то, что причиной эпилептогенеза, являются мутации ионных каналов, в этом случае распространение эпилептиформной активности может быть значительно облегчено. Наличие замкнутых цепочек синаптических переключений, как, например в лимбической системе (гиппокамп - миндалина - кора), позволяет циркулировать эпилептиформной активности и устойчиво существовать в течение длительного времени (Olivier 1991).
Исходя из вышесказанного, одной из задач исследований эпилептогенеза в лабораторных условиях является поиск адекватной модели, в которой можно было бы исследовать генерацию, синхронизацию и распространение эпилептиформной пачечной активности. Это особенно трудно сделать in vitro, в частности на срезах мозга. В таких препаратах не представляется возможным полноценно исследовать распространение эпилептиформной активности в мозге. Кроме того, структура межнейрональных связей не всегда полностью сохраняется, что оказывает влияние как на баланс торможения и возбуждения, так и на возможность синхронизации групп клеток. С другой стороны, диапазон методов доступных in vitro (пейч-кламп, сканирующая конфокальная микроскопия, ПЦР с одной клетки и др.) делает разработку такой модели крайне привлекательной.