- •Научные консультанты:
- •Сокращения и глоссарий
- •Введение
- •Обзор литературы
- •1.1 Торможение в гиппокампе
- •1.1.1 ГамКергическая синаптическая передача
- •1.1.2 ГамКергические рецепторы
- •1.1.3 Разнообразие форм торможения
- •1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического торможения
- •1.2 Взаимодействие между глутамат и гамКергической системами
- •1.2.1 Гетеросинаптические взаимодействия
- •1.2.2 Критерии гетеросинаптической депрессии
- •1.2.3 Метаботропные рецепторы группы III в гиппокампе
- •1.2.4 Каинатные рецепторы в гиппокампе
- •1.3 Механизмы фокального эпилептогенеза
- •1.3.1 Исследования эпилептогенеза
- •1.3.2 Критерии развития эпилептиформной активности
- •1.3.3 Возбуждающие механизмы в эпилептогенезе
- •1.3.4 Тормозные механизмы в эпилептогенезе
- •1.4 Постановка цели и задач исследования
- •2. Материалы и методы
- •2.1 Срезы гиппокампа
- •2.1.1 Приготовление и растворы
- •2.1.2 Рабочая установка для поддержания срезов и манипуляторы
- •2.1.3 Идентификация клеток с помощью световой микроскопии
- •2.2 Регистрация и анализ полевых потенциалов
- •2.3 Записи и анализ токов (потенциалов) в режиме фиксации потенциала (тока) с одиночных нейронов
- •2.3.1 Электроды и внутриклеточные растворы
- •2.3.2 Проведение регистраций и сохранение данных
- •2.3.2 Анализ спонтанных и вызванных ответов в режиме фиксации потенциала
- •2.4 Записи и анализ ответов на ионтофоретические аппликации
- •2.5 Записи и анализ токов с outside-out patch
- •2.5.1 Приготовление outside-out patch
- •2.5.2 Система быстрой аппликации веществ
- •2.5.3 Определение биофизических свойств рецепторов с использованием анализа токов, полученных с outside-out пейчей
- •2.6 Модели эпилептогенеза in vivo
- •2.6.1 Электрический киндлинг
- •2.6.2 Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный киндлинг
- •2.7 Использованные вещества
- •2.8 Статистический анализ
- •3 Результаты исследованИй и их обсуждение
- •3.1 Нетипичные фармакологические свойства гамКергических рецепторов в гиппокампальных интернейронах
- •3.1.1 Различная чувствительность ионотропных гамКергических рецепторов к пикротоксину в интернейронах и пирамидных клетках
- •3.1.2 Ионные каналы ионотропных гамКергических рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках имеют различную проводимость
- •3.1.3 Ионотропные гамКергические рецепторы как в интернейронах, так и пирамидных клетках чувствительны к агонисту гамкс рецепторов
- •3.1.4 Пентобарбитал по-разному модулирует гамКергические токи, вызываемые аппликацией caca (50 м)
- •3.1.5 Тпст в интернейронах, регистрируемые в присутствии 100 м пикротоксина, обладают повышенной чувствительностью к антагонисту гамкс рецепторов
- •3.1.6 Токи, опосредованные гамКергическими рецепторами, в присутствии 100 м пикротоксина возникают за счет характерной Cl-/hco3- ионой проводимости
- •3.1.7 Эффект аллостерических модуляторов гамка рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.8 Сравнение эффективности антагонистов гамка и гамкс рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.9 Интернейроны содержат рецепторы, обладающие нетипичными фармакологическими свойствами
- •3.1.10 Нетипичные гамКергические рецепторы и традиционные типы рецепторов (гамка и гамкс)
- •3.1.11 Возможная субъединичная композиция нетипичных гамКергических рецепторов в интернейронах
- •Заключение
- •3.2 Регуляция возбудимости нейронов гиппокампа за счет гамКергического тонического торможения
- •3.2.1 Базовый тонический гамКергический ток специфичен для интернейронов, но не пирамидных клеток
- •3.2.2 Увеличение внеклеточной концентрации гамк ведет к возникновению тонического тока в пирамидных клетках и повышению в интернейронах
- •3.2.3 Температурная зависимость тонического гамКергического тока и фазических спонтанных тпст
- •3.2.4 Возможная роль тонического торможения в эпилептогенезе
- •3.2.5 Заключение
- •3.3 Модуляция гамКергической передачи в гиппокампе метаботропными рецепторами
- •3.3.1 L-ap4 подавляет и тормозные, и возбуждающие синаптические токи в интернейронах
- •Демонстрирующих отсутствие метаботропных рецепторов группы III на терминалях коллатералей Шаффера, оканчивающихся на пирамидных клетках са1.
- •3.3.2 Синаптически высвобождаемый глутамат снижает тпст
- •3.3.3 Глутамат опосредует гетеросинаптическую депрессию тпст
- •3.3.4 Изменения в эффективности обратного захвата глутамата влияет на гетеросинаптическую депрессию
- •3.3.5 Метаботропные рецепторы группы III опосредуют гетеросинаптическую депрессию по двум различным механизмам
- •3.3.6 Метаботропные рецепторы группы III модулируют частоту спонтанных тпст
- •3.3.7 Возможные молекулярные механизмы депрессии тпст при активации mGluR группы III
- •3.3.8 Последствия активации mGluR группы III для общей возбудимости нейрональной сети поля са1
- •3.3.9 Гетеросинаптическая депрессия, опосредованная метаботропными гамкb рецепторами
- •3.3.10 Заключение
- •3.4 Каинатные рецепторы модулируют гамКергическое торможение в гиппокампальных интернейронах
- •3.4.1 Каинат увеличивает частоту и амплитуду спонтанных тпст в интернейронах
- •3.4.2 Каинат увеличивает вероятность генерации антидромных потенциалов действия в интернейронах
- •3.4.3 Каинат вызывает спонтанные аксональные потенциалы действия
- •3.4.4 Спилловер глутамата активирует аксональные каинатные рецепторы
- •3.4.5 Последствия аксональной деполяризации, вызываемой каинатными рецепторами, для гамКергической передачи
- •3.4.6 Каинат усиливает вызванные тпст в интернейронах
- •3.4.7 Каинат приводит к увеличению гамКергического тонического тока
- •3.4.8 Последствия усиления гамКергической передачи в интернейронах, вызываемой каинатными рецепторами, для возбудимости нейрональной сети
- •3.4.9 Заключение
- •3.5 Оказывают ли метаботропные рецепторы группы III и каинатные рецепторы противоположное действие на гамКергическую передачу?
- •3.6 Механизмы развития пачечной активности в гиппокампе
- •3.6.1 Кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия создают долговременное снижение порога развития пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа
- •3.6.2 Развитие пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа не зависит от активности нейронов поля са3
- •3.6.3 Окклюзия развития пачечных разрядов в поле са1 в ответ на кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия в моделях эпилептогенеза in vivo
- •3.6.4 Является ли пачечная активность в поле са1 гиппокампа эпилептиформной?
- •3.6.5 Способность пирамидных нейронов поля са1 генерировать пачечные разряды сопровождается повышением возбудимости этих клеток
- •3.6.6 Роль nmda рецепторов и l-типа кальциевых каналов в повышение возбудимости пирамидных клеток и генерации пачечных разрядов
- •3.6.7 Заключение
- •Заключение
- •Клеткоспецифичность гамКергического торможения в гиппокампе
- •Клеткоспецифичность модуляции гамКергического торможения в гиппокампе
- •Возбудимость и торможение в эпилептогенезе
- •Эффектов веществ влияющих на гамКергические механизмы, описанные в данной диссертационной работе, представлена втаблице 4.1 (см также Рис. 4.1). Выводы
- •Список рисунков
- •Список литературы
1.3.3 Возбуждающие механизмы в эпилептогенезе
Эпилептиформная активность связана с повышенной возбудимостью принципиальных клеток. Поскольку в нормальном мозге существует определенный уровень тормозных и возбуждающих влияний, баланс между ними определяет возбудимость нейронов. Таким образом, можно разделить механизмы, приводящие к к эпилептогенезу, на повышающие возбуждение и снижающие торможение.
Одним из механизмов, повышающих эффективность возбуждающей глутаматергической передачи, является ее долговременная потенциация (LTP). Интересно, что эпилептиформная активность, возникающая при киндлинге, имеет ряд сходных механизмов с NMDA рецептор зависимой LTP (Cain 1989; McEachern and Shaw 1996). Это подтверждается тем, что вещества, блокирующие NMDA рецепторы, замедляют процесс развития судорожной активности при киндлинге, хотя и не играют роли, если эпилептиформная активность уже выражена (Behr et al. 2001; Borowicz et al. 2001). Эти данные говорят о том, что LTP может принимать участие в развитии эпилептиформной активности, хотя не является критическим фактором. В пользу этого свидетельствует и то, что антагонисты NMDA рецепторов в концентрациях, полностью подавляющих LTP, лишь замедляют киндлинг (Gilbert and Mack 1990; Leung 1994). С другой стороны, показано, что при киндлинге происходят изменения в мРНК, кодирующей NMDA рецепторы (Kamphuis et al. 1995; Pratt et al. 1993). Кроме эффекта на мРНК, киндлинг приводит к долговременным посттрансляционным модификациям каналов NMDA рецепторов. При этом увеличивается среднее временя открытого состояния канала и снижается блокирующий эффект магния (Kohr et al. 1993).
Помимо изменений в свойствах NMDA рецепторов, накопление внеклеточного глутамата может играть роль в эпилептогенезе. Например, у грызунов, у которых отсутствует ген, кодирующий глиальный транспортер глутамата – GLT1, наблюдаются летальные спонтанные судороги (Tanaka et al. 1997).
В основе генерации эпилептиформных пачечных разрядов может лежать резкая деполяризация нейрона в форме пароксизмального деполяризационного сдвига (ПДС). Предполагается, что этот сдвиг потенциала клетки может формироваться в результате суммации ВПСП (Jefferys 1990). В качестве доказательства приводятся сходство форм и величин деполяризации при ПДС и ВПСП.
1.3.4 Тормозные механизмы в эпилептогенезе
ГАМКергические механизмы претерпевают значительные изменения при эпилептогенезе. Известно, что при некоторых генетических формах предрасположенности к судорожной активности наблюдается снижение эффективности ГАМКергического торможения (Faingold et al. 1994; Jobe and Laird 1981; Веретенников с соавт. 1996). В экспериментальных моделях эпилептогегеза происходят изменения субъединичного состава ГАМКергических рецепторов (Brooks-Kayal et al. 1998; Schwarzer et al. 1997), эффективности высвобождения и обратного захвата ГАМК (Treiman 2001). Однако, вопрос о том, повышается или снижается ГАМКергическое торможение при эпилептогенезе остается спорным (Mody 1998). Общий принцип сводится приблизительно к следующему: острые, длительные судороги приводят к снижению торможения, тогда как в хронических моделях происходит его увеличение. В хронических моделях увеличивается число ГАМКергических рецепторов в синапсах (Nusser et al. 1998a) и число самих синапсов (Prince and Jacobs 1998). В некоторых случаях наблюдается увеличение пресинаптического высвобождения ГАМК (Chen et al. 1999).
Как указывалось выше, тормозные интернейроны могут принимать участие в синхронизации эпилептиформной активности за счет ребаунд эффекта в группе возбуждающих клеток, которые они одновременно иннервируют. В гиппокампе и других структурах коры тормозные интернейроны имеют сильноразветвленные связи со многими пирамидными нейронами, которые, в свою очередь, возбуждают эти интернейроны посредством возвратных коллатералей аксонов (Mody et al. 1994). Таким образом, организуется система с положительной обратной связью, способная поддерживать эпилептиформную активность.
Однако, если роль синаптической формы торможения в эпилептогенезе активно обсуждается, то роль тонического изучена слабо. Можно предположить, что при повышенной активности нейронов внеклеточная концентрация ГАМК повышается за счет синаптического возбуждения интернейронов и высвобождения ими этого нейропередатчика. Повышение внеклеточной концентрации тормозного нейропередатчика снижает общую возбудимость нейрональной сети за счет тонического торможения. Эти события представляют собой внутренний защитный механизм против эпилептогенеза. Возможность данной схемы подтверждается тем, что антиэпилептический препарат – тиагабин, увеличивает внеклеточную концентрацию ГАМК, блокируя ее обратный захват (uptake) (Morimoto et al. 1997).
Таким образом, при эпилептогенезе наблюдаются существенные изменения как в возбуждающей глутаматергической, так и тормозной ГАМКергической системах нейропередачи. Важную роль в изменении эффективности глутаматергической нейропередачи и в эпилептогенезе играет NMDAподтип глутаматергических рецепторов. Недавно было продемонстрировано, что активация L-типа Ca2+каналов может приводить к пластическим изменениям в ГАМКергических синапсах (Jensen and Mody 2001). Другие данные указывают, что сами изменения в кальциевой проводимости играют ключевую роль в эпилептогенезе (Chaisewikul et al. 2001; Pal et al. 2001; Tashiro et al. 2002). Наконец, были продемонстрированы мутации в кальциевых каналах при клинических случаях эпилепсии (Burgess and Noebels 2000; Chioza et al. 2001; Jouvenceau et al. 2001).
Исходя из вышеизложенного, следующей задачей представленной диссертационной работы была оценка роли NMDA рецептор зависимого (связанного с модуляцией эффективности возбуждающей глутаматергической передачи) и зависимого от L-типа кальциевых каналов (связанного с модуляцией эффективности тормозной ГАМКергической передачи и возбудимостью внесинаптической мембраны нейронов) входов Ca2+для генерации пачечной активности в гиппокампе.