12. Заключение

Таким образом, в данном разделе работы было показано:

1. ГАМКергические ТПСТ в интернейронах менее чувствительны к пикротоксину, а ГАМКергические рецепторы обладают более низкой средней проводимостью одиночного канала, чем в пирамидных клетках.

2. CACA, агонист ГАМК_Срецепторов, вызывает ток как в интернейронах, так и пирамидных клетках. В пирамидных нейронах ток, вызываемый CACA, нечувствителен к пентобарбиталу, что характерно для классических ГАМК_Срецепторов. В интернейронах пентобарбитал значительно усиливает этот ток, что указывает на наличие в них нетипичных ГАМКергических рецепторов.

3. Аппликация 100 μМ пикротоксина фармакологически изолирует популяцию ГАМКергических рецепторов в интернейронах, которая обладает фармакологическим свойствами (чувствительность к агонистам, антагонистам и аллостерическим модуляторам) как ГАМК_А, так и ГАМК_Срецепторов. Эти рецепторы обладают Cl^-/HCO₃^-проводимостью, характерной для ионотропных типичных ГАМКергических рецепторов.

Таким образом, нам удалось показать наличие в интернейронах str.radiatum, но не пирамидных клетках поля CA1 гиппокампа, ГАМКергических рецепторов, фармакологически отличных от всех на настоящее время известных рецепторов. Они сочетают в себе свойства как ГАМК_А, так и ГАМК_Срецепторов, при этом обладают сниженной чувствительностью к пикротоксину.

Различие в фармакологических свойствах ГАМКергических рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках предоставляет возможность поиска веществ, специфически воздействующих на ту или иную популяцию клеток в гиппокампе. Селективное изменение торможения тормозных или возбуждающих нейронов может быть использовано для изменения возбудимости всей структуры в целом и лежать в основе разработки антиэпилептических препаратов.

3.2 Регуляция возбудимости нейронов гиппокампа за счет гамКергического тонического торможения

Тоническое торможение представляет собой форму фонового торможения за счет постоянной активации внесинаптических ГАМКергических рецепторов (Soltesz and Nusser 2001). ГАМКергическое тоническое торможение является важным механизмом регуляции возбудимости нейрональной сети. В представленной работе мы исследовали механизмы этого феномена в интернейронах и пирамидных клетках гиппокампа.

3.2.1 Базовый тонический гамКергический ток специфичен для интернейронов, но не пирамидных клеток

Мы произвели записи токов в режиме фиксации потенциала с интернейронов str.radiatumи пирамидных клеток поля СА1. Ток, опосредованный ионотропными ГАМКергическими рецепторами, был фармакологически изолирован при блокадеAMPA/каинатных,NMDA, ГАМК_Ви метаботропных группыIIIрецепторов. Для этого в раствор Рингера были добавленыNBQX(50 µМ),DL-2-амино-5-фосфоновалерат (APV, 100 µМ),CGP52432 (5 µМ) и α-метилсерин-О-фосфат (MSOP, 100 µМ), соответственно. Тонический ток, опосредованный ионотропными ГАМКергическими рецепторами, регистрировался как часть тока компенсации, которая подавлялась высокой концентрацией пикротоксина (100 µМ). Аппликация пикротоксина в этой концентрации подавляла спонтанные ГАМКергические ТПСТ (сТПСТ) как в интернейронах, так и в пирамидных клетках. Однако, снижение тока компенсации при этом наблюдалось только в интернейронах, но не пирамидных клетках (69 ± 10 % от базовых значений;n=5;p=0,04 в интернейронах и 103 ± 3 % от базовых значений;n=4;

Рис. 3.2.1 Пикротоксин подавляет сТПСТ как в интернейронах, так и пирамидных клетках

а, Оригинальные записи, полученные с одного интернейрона (ИН) и одной пирамидной клетки (ПК) до и после аппликации 100 µМ пикротоксина. Пикротоксин полностью подавлял спонтанные ТПСТ как в интернейронах, так и пирамидных клетках. Снижение тока компенсации при аппликации этого вещества происходило только в интернейронах.б, Усредненные данные по эффекту 100 µМ пикротоксина, полученные в нескольких экспериментах. Данные нормированы к величине тока компенсации до аппликации пикротоксина в каждой отдельной клетке. Пикротоксин снижал ток компенсации в интернейронах (ИН) до 69 ± 10 % (n=5;p=0.04) от базовых значений (пунктирная линия), но не вызывал значительного его изменения в пирамидных клетках (103 ± 3 %;n=4;p=0,28; ПК). *:p<0,05

p=0,28 в пирамидных клетках; рис. 3.2.1).

Существует предположение, что в основе ГАМКергического тонического тока лежит суммация сТПСТ (Salin and Prince 1996; Soltesz et al. 1995). В этом случае тонический ток и сТПСТ должны быть одинаково чувствительны к антагонистам ионотропных ГАМКергических рецепторов. Использованная концентрация пикротоксина не выявила различий между этими двумя формами торможения. Эти данные указывают, что именно суммация сТПСТ в интернейронах может определять наличие тонического тока. Однако, в таком случае становится не понятно, почему основные характеристики спонтанной активности в интернейронах и пирамидных клетках одинаковы, а тонического тока в пирамидных нейронах нет (Рис 3.2.1). Для ответа на этот вопрос мы решили проверить, не будет ли наблюдаться различий в чувствительности тонического тока и сТПСТ к более низким концентрациям пикротоксина. Для этого мы исследовали как последовательное увеличение концентрации пикротоксина в растворе будет влиять на общий ток, переносимый сТПСТ (ОТ-сТПСТ, средний заряд переносимый единичным сТПСТ умноженный на частоту сТПСТ), и на ГАМКергический тонический ток (считая его абсолютную величину равной той части тока компенсации, которая подавлялась при добавлении 100 µМ пикротоксина) (Рис. 3.2.2а). Оказалось, что тонический ГАМКергический ток более чувствителен к низким концентрациям пикротоксина, чем общий ток сТПСТ (IC₅₀(I_тон)=2 µМ иIC₅₀ (ОТ-сТПСТ)=12 µМ; Рис. 3.2.2б).

Ранее было показано, что SR95531 (габазин), специфический антагонист ГАМК_Арецепторов, может селективно подавлять фазические ТПСТ, не влияя на ГАМКергический тонический ток, в диссоциированной культуре гиппокампальных нейронов (Bai et al. 2001). Однако в диссоциированной культуре трудно определить, какая клетка является интернейроном, а какая пирамидным нейроном. Мы проверили какой эффектSR95531 будет оказывать на тонический ток в интернейронах. Низкая концентрация этого антагониста (0.5 µМ) подавляла сТПСТ, но не приводила к изменениям в токе компенсации ни в интернейронах, ни пирамидных клетках (Рис. 3.2.3). Ток компенсации в присутствии габазина был 110 ± 7 % от тока до его аппликации (n=6;p=0,09) в интернейронах и 94 ± 6 % (n=4;p=0,34) в пирамидных клетках. Эти данные указывают на возможность использования низких концентраций пикротоксина как более специфического блокатора тонического ГАМКергического тока, аSR95531 как селективного блокатора сТПСТ (фазических токов).

Рис.3.2.2 Тонический ток, опосредованный ионотропными ГАМКергическими рецепторами, и фазические токи (сТПСТ) в интернейронах обладают разной чувствительностью к пикротоксину

а, Пикротоксин (PTX) в зависимости от концентрации снижал как ток компенсации, так и общий ток, переносимый спонтанными ТПСТ (ОТ-сТПСТ). Зависимости токов получены с одного интернейрона. Точечная линия показывает средний ток компенсации в присутствии 100 µМ пикротоксина на верхней панели и нуль тока ОТ-сТПСТ на нижней. Низкие концентрации антагониста более эффективно подавляли ионотропные ГАМКергические рецепторы, опосредующие тонический ток, чем рецепторы, опосредующие спонтанные ТПСТ.б, Кривые концентрация-эффект, полученные для действия пикротоксина на ГАМКергический тонический ток (часть тока компенсации, которая подавлялась аппликацией 100 µМ пикротоксина) и общий ток, переносимый спонтанными ТПСТ, в интернейронах (n=7)str.radiatumполя СА1 гиппокампа. Тонический ток и ОТ-сТПСТ нормировались к их средним значениям до аппликации пикротоксина. Кривые были аппроксимированы по уравнению Хилла (метод наименьших квадратов). Оптимальные коэффициенты Хилла были сходными 0,91 и 0,94 для тонического тока (I_тон) и для ОТ-сТПСТ, соответственно. При этомIC₅₀для тонического тока был 2 µМ, а для ОТ-сТПСТ 12 µМ.

Рис. 3.2.3 Низкая концентрация SR95531 (0,5 µМ) селективно блокировала спонтанные ТПСТ, но не оказывала значительного эффекта на ток компенсации

а, Оригинальные записи, полученные с одного интернейрона (ИН) и одной пирамидной клетки (ПК) до и после аппликации 0,5 µМSR95531. Аппликация низкой концентрацииSR95531 подавляла спонтанные ТПСТ, но не оказывала значительного эффекта на ток компенсации ни в интернейронах, ни в пирамидных клетках.б, Усредненные данные, полученные с нескольких клеток. Ток компенсации был нормирован к его среднему значению до аппликации 0,5 µМSR95531 в каждой клетке. Ток компенсации в присутствииSR95531 в интернейронах был 110 ± 7 % (n=6;p=0,09) от базовых значений (пунктирная линия) и 94 ± 6 % (n=4;p=0.34) в пирамидных клетках.