2.3 Записи и анализ токов (потенциалов) в режиме фиксации потенциала (тока) с одиночных нейронов

2.3.1 Электроды и внутриклеточные растворы

Стимулирующие электроды

В большинстве случаев в данных экспериментах для электрической стимуляции использовались монополярные и биполярные электроды из нержавеющей стали компании Frederic Haer & Co (США). Однако, в экспериментах, где требовалась точная установка и перемещения электрода для поиска оптимальной позиции использовался стеклянный микроэлектрод, заполненный раствором Рингера. Это делалось, например, при регистрации антидромного тока действия в интернейронах. В этом случае необходимо было найти область, куда распространялся аксон этих клеток.

Для получения моносинаптических ТПСТ и/или ВПСТ в интернейронах или пирамидных клетках электрод устанавливался в str.radiatum поля СА1 (Рис. 2.4а). Для активации независимых наборов волокон два стимулирующих электрода устанавливались в str.radiatum по разные стороны от клетки, с которой велась запись. Длительность стимула была 20с. Амплитуда стимула подбиралась в соответствии с задачей эксперимента. При регистрации ТПСТ или ВПСТ, она устанавливалась таким образом, чтобы синаптический ток был приблизительно 600 пА. Для регистрации антидромных токов действия в интернейронах, стеклянный стимулирующий электрод устанавливался в str.orience. Затем, позиция этого электрода и сила стимула менялись таким образом, чтобы получить ток действия при стимуляции аксона клетки, по возможности, без сопровождающего синаптического тока от стимуляции соседних терминалей.

Для оценки одиночных моносинаптических токов интервал между стимулами был не меньше 10 секунд. Для оценки коэффициента парной стимуляции использовались два стимула с интервалом 50 мс. Частотно-зависимая модуляция ТПСТ исследовалась при частоте 5 Гц. В экспериментах с гетеросинаптической депрессией дистальный электрод использовался для высокочастотной стимуляции глутаматергических коллатералей (5 стимулов 50/100 Гц) с целью высвобождения глутамата. Тестовый стимул подавался на проксимальный электрод и следовал с интервалом 50 или 100 мс после стимуляции коллатералей. Это делалось для оценки модулирующего влияния спилловера глутамата на амплитуду ТПСТ (в случае исследования mGluR группы III) или вероятность возникновения антидромного тока действия (в случае исследования аксональных каинатных рецепторов).

Регистрирующие электроды

Записи производились в режиме whole-cell с интернейронов (Рис. 2.2 и 2.4а) и пирамидных клеток (Рис. 2.2) поля СА1. Регистрирующие электроды вытягивались из капилляров стекла GC150F-7.5 (HarvardApparatusLTD, Великобритания) с помощью программируемого вытягивающего устройства фирмыSutterInstruments(USA) модельP-87. Сопротивление электродов было 4-5 МΩ.

Растворы для заполнения пейч-кламповских электродов

В зависимости от задачи использовались растворы с различным содержанием ионов хлора, что позволяло изменять потенциал реверсии для токов, опосредованных ГАМКергическими рецепторами. Кроме того, в ряде растворов использовался QX314, внутриклеточный блокатор Na⁺каналов, использование которого позволяло избавиться от спонтанных потенциалов действия в клетке. В случае исследования клеточных разрядов, QX314 в раствор не добавлялся.

Основные растворы были следующие:

Рис. 2.4 Схема регистрации синаптических токов на примере интернейрона поля СА1 гиппокампа

а, Расположение стимулирующего и регистрирующего электродов в str.radiatum поля СА1 среза гиппокампа.б, Вид отдельного интернейрона с установленным на нем пейч-кламповским электродом.в, Токи, регистрируемые в интернейронах в режиме фиксации потенциала с использованием внутриклеточного раствора на базе CsCl.в₁– синаптический ток, вызванный электрической стимуляцией и усредненный по 5 последовательным записям;в₂– пример записи спонтанных синаптических токов с вставкой, увеличивающей отдельный участок записи;в₃- усредненный по 5 последовательным записям ток в ответ на прямоугольный сдвиг потенциала с ‑60 до ‑65 мВ, использовавшийся для оценки сопротивления мембраны клеток и стабильности регистраций.

1. Раствор на основе CsCl использовался для исследования ТПСТ и ВПСТ, которые изолировались фармакологически (с использованием антагонистов). Это связано с тем, что высокая концентрация ионов хлора внутри клетки приводит к изменению потенциала реверсии для тормозных ГАМКергических токов, и они становятся негативно направленными, как и возбуждающие. Данный раствор содержал (в мМ): CsCl 120; NaCl 8; HEPES 10; EGTA 2; MgCl₂0,2; MgАТФ 2; ГТФ 0,3 и QX314Br (pH 7,2; осмолярность 290 мОсм) и приготавливался в объеме 50 мл, после чего помещался 500 µл эппендорфы и замораживался.

2. Раствор на основе глюконата цезия использовался для разделения ТПСТ и ВПСТ без использования антагонистов. Этот раствор не менял значительно потенциал реверсии для хлора в клетках. В этом случае в режиме фиксации потенциала при ‑60 мВ ТПСТ и ВПСТ были разнонаправлены. Использование этого раствора и раствора с высоким содержанием хлора позволило также исследовать участие хлорной проводимости в синаптическом токе, сравнивая экспериментально полученные потенциалы реверсии синаптических токов с их значениями, предсказанными по уравнению Нернста. Этот содержал (в мМ): цезия глюконат 102,5; CsCl 17,5; NaCl 8; HEPES 10; EGTA 2; MgCl₂0,2; MgАТФ 2; ГТФ 0,3 и QX314Br (pH 7,2; осмолярность 290 мОсм). Раствор приготавливался и хранился таким же образом, как и раствор на основе CsCl.

3. Раствор на основе KCl использовался для исследования порога и паттерна ренерации потенциалов и токов действия в режиме фиксации тока и потенциала, соответственно. В связи с этим в раствор не добавлялся QX314. Исследовались как спонтанные, так и вызванные разряды клеток. В режиме фиксации тока потенциалы действия вызывались с помощью деплояризующего сдвига потенциала. В режиме фиксации потенциала генерация потенциалов действия регистрировалась в виде токов действия. Токи действия могли быть получены при антидромной стимуляции аксона или при деполяризующем потенциале фиксации. Раствор на основе KCl содержал (в мМ): KCl 145; NaCl 8; HEPES 10; EGTA 2; MgCl₂0,2; MgАТФ 2; ГТФ 0,3 (pH 7,2; осмолярность 290 мОсм). Раствор приготавливался и хранился также как и два предыдущих.

Различие в осмолярности между внеклеточным и внутриклеточным растворами приблизительно в 5-10 мОсм, приводило к более стабильной регистрации. Это было необходимо для исследования тонического ГАМКергического торможения, которое оценивалось по изменению тока компенсации в режиме фиксации потенциала.