- •Научные консультанты:
- •Сокращения и глоссарий
- •Введение
- •Обзор литературы
- •1.1 Торможение в гиппокампе
- •1.1.1 ГамКергическая синаптическая передача
- •1.1.2 ГамКергические рецепторы
- •1.1.3 Разнообразие форм торможения
- •1.1.4 Механизмы и функциональное значение тонического торможения
- •1.2 Взаимодействие между глутамат и гамКергической системами
- •1.2.1 Гетеросинаптические взаимодействия
- •1.2.2 Критерии гетеросинаптической депрессии
- •1.2.3 Метаботропные рецепторы группы III в гиппокампе
- •1.2.4 Каинатные рецепторы в гиппокампе
- •1.3 Механизмы фокального эпилептогенеза
- •1.3.1 Исследования эпилептогенеза
- •1.3.2 Критерии развития эпилептиформной активности
- •1.3.3 Возбуждающие механизмы в эпилептогенезе
- •1.3.4 Тормозные механизмы в эпилептогенезе
- •1.4 Постановка цели и задач исследования
- •2. Материалы и методы
- •2.1 Срезы гиппокампа
- •2.1.1 Приготовление и растворы
- •2.1.2 Рабочая установка для поддержания срезов и манипуляторы
- •2.1.3 Идентификация клеток с помощью световой микроскопии
- •2.2 Регистрация и анализ полевых потенциалов
- •2.3 Записи и анализ токов (потенциалов) в режиме фиксации потенциала (тока) с одиночных нейронов
- •2.3.1 Электроды и внутриклеточные растворы
- •2.3.2 Проведение регистраций и сохранение данных
- •2.3.2 Анализ спонтанных и вызванных ответов в режиме фиксации потенциала
- •2.4 Записи и анализ ответов на ионтофоретические аппликации
- •2.5 Записи и анализ токов с outside-out patch
- •2.5.1 Приготовление outside-out patch
- •2.5.2 Система быстрой аппликации веществ
- •2.5.3 Определение биофизических свойств рецепторов с использованием анализа токов, полученных с outside-out пейчей
- •2.6 Модели эпилептогенеза in vivo
- •2.6.1 Электрический киндлинг
- •2.6.2 Модель аудиогенной судорожной активности. Аудиогенный киндлинг
- •2.7 Использованные вещества
- •2.8 Статистический анализ
- •3 Результаты исследованИй и их обсуждение
- •3.1 Нетипичные фармакологические свойства гамКергических рецепторов в гиппокампальных интернейронах
- •3.1.1 Различная чувствительность ионотропных гамКергических рецепторов к пикротоксину в интернейронах и пирамидных клетках
- •3.1.2 Ионные каналы ионотропных гамКергических рецепторов в интернейронах и пирамидных клетках имеют различную проводимость
- •3.1.3 Ионотропные гамКергические рецепторы как в интернейронах, так и пирамидных клетках чувствительны к агонисту гамкс рецепторов
- •3.1.4 Пентобарбитал по-разному модулирует гамКергические токи, вызываемые аппликацией caca (50 м)
- •3.1.5 Тпст в интернейронах, регистрируемые в присутствии 100 м пикротоксина, обладают повышенной чувствительностью к антагонисту гамкс рецепторов
- •3.1.6 Токи, опосредованные гамКергическими рецепторами, в присутствии 100 м пикротоксина возникают за счет характерной Cl-/hco3- ионой проводимости
- •3.1.7 Эффект аллостерических модуляторов гамка рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.8 Сравнение эффективности антагонистов гамка и гамкс рецепторов на устойчивые к пикротоксину токи, опосредованные гамКергическими рецепторами
- •3.1.9 Интернейроны содержат рецепторы, обладающие нетипичными фармакологическими свойствами
- •3.1.10 Нетипичные гамКергические рецепторы и традиционные типы рецепторов (гамка и гамкс)
- •3.1.11 Возможная субъединичная композиция нетипичных гамКергических рецепторов в интернейронах
- •Заключение
- •3.2 Регуляция возбудимости нейронов гиппокампа за счет гамКергического тонического торможения
- •3.2.1 Базовый тонический гамКергический ток специфичен для интернейронов, но не пирамидных клеток
- •3.2.2 Увеличение внеклеточной концентрации гамк ведет к возникновению тонического тока в пирамидных клетках и повышению в интернейронах
- •3.2.3 Температурная зависимость тонического гамКергического тока и фазических спонтанных тпст
- •3.2.4 Возможная роль тонического торможения в эпилептогенезе
- •3.2.5 Заключение
- •3.3 Модуляция гамКергической передачи в гиппокампе метаботропными рецепторами
- •3.3.1 L-ap4 подавляет и тормозные, и возбуждающие синаптические токи в интернейронах
- •Демонстрирующих отсутствие метаботропных рецепторов группы III на терминалях коллатералей Шаффера, оканчивающихся на пирамидных клетках са1.
- •3.3.2 Синаптически высвобождаемый глутамат снижает тпст
- •3.3.3 Глутамат опосредует гетеросинаптическую депрессию тпст
- •3.3.4 Изменения в эффективности обратного захвата глутамата влияет на гетеросинаптическую депрессию
- •3.3.5 Метаботропные рецепторы группы III опосредуют гетеросинаптическую депрессию по двум различным механизмам
- •3.3.6 Метаботропные рецепторы группы III модулируют частоту спонтанных тпст
- •3.3.7 Возможные молекулярные механизмы депрессии тпст при активации mGluR группы III
- •3.3.8 Последствия активации mGluR группы III для общей возбудимости нейрональной сети поля са1
- •3.3.9 Гетеросинаптическая депрессия, опосредованная метаботропными гамкb рецепторами
- •3.3.10 Заключение
- •3.4 Каинатные рецепторы модулируют гамКергическое торможение в гиппокампальных интернейронах
- •3.4.1 Каинат увеличивает частоту и амплитуду спонтанных тпст в интернейронах
- •3.4.2 Каинат увеличивает вероятность генерации антидромных потенциалов действия в интернейронах
- •3.4.3 Каинат вызывает спонтанные аксональные потенциалы действия
- •3.4.4 Спилловер глутамата активирует аксональные каинатные рецепторы
- •3.4.5 Последствия аксональной деполяризации, вызываемой каинатными рецепторами, для гамКергической передачи
- •3.4.6 Каинат усиливает вызванные тпст в интернейронах
- •3.4.7 Каинат приводит к увеличению гамКергического тонического тока
- •3.4.8 Последствия усиления гамКергической передачи в интернейронах, вызываемой каинатными рецепторами, для возбудимости нейрональной сети
- •3.4.9 Заключение
- •3.5 Оказывают ли метаботропные рецепторы группы III и каинатные рецепторы противоположное действие на гамКергическую передачу?
- •3.6 Механизмы развития пачечной активности в гиппокампе
- •3.6.1 Кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия создают долговременное снижение порога развития пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа
- •3.6.2 Развитие пачечных разрядов в поле са1 гиппокампа не зависит от активности нейронов поля са3
- •3.6.3 Окклюзия развития пачечных разрядов в поле са1 в ответ на кратковременные увеличения внеклеточной концентрации калия в моделях эпилептогенеза in vivo
- •3.6.4 Является ли пачечная активность в поле са1 гиппокампа эпилептиформной?
- •3.6.5 Способность пирамидных нейронов поля са1 генерировать пачечные разряды сопровождается повышением возбудимости этих клеток
- •3.6.6 Роль nmda рецепторов и l-типа кальциевых каналов в повышение возбудимости пирамидных клеток и генерации пачечных разрядов
- •3.6.7 Заключение
- •Заключение
- •Клеткоспецифичность гамКергического торможения в гиппокампе
- •Клеткоспецифичность модуляции гамКергического торможения в гиппокампе
- •Возбудимость и торможение в эпилептогенезе
- •Эффектов веществ влияющих на гамКергические механизмы, описанные в данной диссертационной работе, представлена втаблице 4.1 (см также Рис. 4.1). Выводы
- •Список рисунков
- •Список литературы
3.4.8 Последствия усиления гамКергической передачи в интернейронах, вызываемой каинатными рецепторами, для возбудимости нейрональной сети
Полученные результаты показывают, что каинат снижает порог генерации потенциалов действия в интернейронах и вызывает увеличение тонического ГАМКергического торможения. Эффект каината на ТПСТ в интернейронах отличен от его эффекта на синаптические токи в других клетках гиппокампа. Каинат подавляет нейропередачу в мшистых волокнах и тормозную синаптическую ГАМКергическую передачу в пирамидных нейронах, тогда как увеличивает амплитуду ТПСТ в интернейронах str.radiatum поля CA1 гиппокампа. Это увеличение может быть объяснено снижением порога генерации потенциалов действия при деполяризации аксонов, которое ведет к тому, что большее число пресинаптических нейронов будет активироваться при электрической стимуляции. В подтверждение тому было показано, что, в отличие от воздействий, меняющих вероятность высвобождения медиатора, каинат не значительно изменял коэффициент парной стимуляции. Таким образом, эффект каината на амплитуду ТПСТ в интернейронах поля СА1 срезов гиппокампа связан с увеличением эффективности проведения сигнала по пресинаптическим теминалям.
В отличие от предыдущих исследований (Cossart et al. 1998; Frerking et al. 1998), мы не смогли найти подтверждения участия каинатных рецепторов в постсинаптическом токе. Вместо этого, результаты данной работы подтверждают гипотезу о роли внесинаптических каинатных рецепторов в регуляции клеточной возбудимости. Строго говоря, вопрос, где находятся каинатные рецепторы, требует применения высокоразрешающих иммуноцитохимических методов, использование которых затруднено тем, что пока не созданы адекватные антитела на каинатные рецепторы, в частности на GluR5 и GluR6 субъединицы, которые находятся в интернейронах (Mulle et al. 2000; Paternain et al. 2000).
Усилению вызванных ТПСТ при аппликации 1 μМ каината предшествует ранняя и кратковременная депрессия ТПСТ, связанная с постсинаптическим шунтированием. Аналогичный феномен, наблюдаемый в пирамидных нейронах, объясняется значительным накоплением внеклеточной концентрации ГАМК, вызванным разрядами интернейронов (Frerking et al. 1999). Обобщая полученные результаты, мы предлагаем следующую последовательность событий. Каинат деполяризует интернейроны. Деполяризация приводит к увеличению вероятности спонтанного и вызванного высвобождения ГАМК. Затем внеклеточная концентрация ГАМК шунтирует синаптические токи, активируя тоническую ГАМКергическую проводимость (так же как и приводит к десенситизации ГАМКАрецепторов и активации ГАМКВрецепторов, если они не заблокированы фармакологически). По мере того, как эффект каината снижается при его отмывке, феномен постсинаптического шунтирования ослабляется и проявляется фасилитация фазической ГАМКергической передачи. Затем эта фасилитация сохраняется довольно длительное время, что объясняется либо долговременными механизмами, запускаемыми при активации каинатных рецепторов, либо медленной кинетикой отмывания каината из среза.
Гипотеза о том, что каинат облегчает распространение потенциалов действия, предполагает, что каинат также должен усиливать ТПСТ в пирамидных нейронах. Однако, эффект каината на ТПСТ в этих клетках совершенно отличен от эффекта на ТПСТ в интернейронах. В пирамидных нейронах каинат снижает амплитуду вызванных ТПСТ. Остается неясным является ли это снижение полностью связанным с накоплением внеклеточной ГАМК, которое приводит к повышению тонического ГАМКергического тока (с последующим эффектом шунтирования) и к активации ГАМКВрецепторов (вызывающих пресинаптическую депрессию) (Frerking et al. 1999) или отражает прямой эффект каината на экзоцитоз ГАМК (Rodriguez-Moreno and Lerma 1998; Rodriguez-Moreno et al. 2000). Объяснение причин клеточной специфичности эффекта каината, не входило в цели данной работы. Тем не менее, могут быть предложены следующие варианты. Во-первых, механизмы подавления нейропередачи могут быть более выраженными и более длительными в пирамидных нейронах, скрывая увеличение потенциал действия зависимого высвобождения ГАМК. Во-вторых, аксоны, иннервирующие две различные популяции нейронов, могут различаться в плане распределения каинатных рецепторов и/или распространения потенциалов действия. В-третьих, каинатные рецепторы могут модулировать различные популяции интернейронов в различной степени. Однако, не было показано четкой зависимости эффектов, опосредованных каинатными рецепторами, от морфологии или расположения интернейронов (Cossart et al. 1998). Наконец, в-четвертых, возможна совершенно простая логическая схема. Каинат действительно облегчает генерацию потенциалов действия во всех типах клеток. Однако, интернейроны, иннервирующие пирамидные клетки (”ингибиторные”), тормозятся другими интернейронами (”дезингибиторными”) (Gulyas et al. 1996). При общем росте возбудимости интернейронов на фоне активации каинатных рецепторов наибольшее тормозное влияние, вероятно, получают ”ингибиторные” интернейроны. Принимая во внимание рост тонического ГАМКергического тока, активация каинатных рецепторов в этих клетках может оказаться недостаточной для эффективного повышения их возбудимости и увеличения торможения пирамидных клеток.