3.4.6 Каинат усиливает вызванные тпст в интернейронах

В предыдущих экспериментах мы показали, что каинат увеличивает возбудимость аксонов интернейронов. Этот эффект должен приводить к тому, что вызванные ТПСТ в постсинаптических клетках должны также увеличиваться. Для исследования модуляции каинатными рецепторами вызванных ГАМКергических ТПСТ мы блокировали AMPA, NMDA, ГАМК_Bи метаботропные рецепторы группы III (mGluR III) с использованием GYKI53655 (50 μМ), DL‑2‑амино‑5‑фосфоновалерата (APV, 100 μМ), CGP52432 (5 μМ) и α‑метилсерин‑O‑фосфата (MSOP, 100 μМ), соответственно. В этих условиях внеклеточная стимуляция вызывала синаптический ток в интернейронах str.radiatum, который полностью подавлялся антагонистами ГАМК_Арецепторов бикукуллином (10 μМ) и пикротоксином (100 μМ) (рис. 3.4.6). Эффект антагонистов тестировался в конце каждого эксперимента и указывает на то, что весь регистрируемый ток был опосредован ионотропными ГАМК рецепторами, а каинатные рецепторы не принимают в нем участия. Ток, опосредованный каинатными рецепторами, не регистрировался даже при высокочастотной стимуляции (5 стимулов при 100 Гц). Эти результаты отличаются от предыдущих публикаций о том, что синаптические токи вызываемые в интернейронах срезов гиппокампа крыс часто (но не всегда) содержат значительный компонент, опосредуемый каинатными рецепторами (Cossart et al. 1998; Frerking et al. 1998). Такое отличие можно объяснить

Рис. 3.4.6 Фармакологическое выделение ТПСТ, опосредованных ионотропными ГАМКергическими рецепторами

Стимуляция (Стимулятор) проводилась в str.radiatum поля СА1 с целью регистрации в интернейронах (Усилитель) вызванного моносинаптического ГАМКергического ТПСТ. Оригинальные записи, полученные с одного интернейрона (усреднение по 10 последовательным регистрациям) показаны на правой панели рисунка. Бикукуллин (10 µМ) полностью подавлял ТПСТ, не смотря на то, что каинатные рецепторы не были блокированы (ответ справа внизу), указывая на то, что каинатные рецепторы не принимают участие в постсинаптическом токе.

видовыми различиями, которые могут отражаться в плотности каинатных рецепторов и/или их близостью к месту выброса медиатора (см. для сравнения предыдущие данные по модуляции каинатом миниатюрных ТПСТ в интернейронах крыс и морских свинок).

На основании того, что каинатные рецепторы не вносили в наших экспериментальных условиях значительного вклада в синаптические токи, мы предположили, что действие каината не будет отражать прямой постсинаптический эффект на рецепторы, опосредующие вызванные ответы. Кроме того, блокировав ГАМК_Bи mGluR III, мы постарались избежать непрямого действия каината на высвобождение медиатора за счет накопления внеклеточной ГАМК и глутамата, и активации этими нейропередатчиками соответствующих типов метаботропных рецепторов (Frerking et al. 1999).

Аппликация каината в концентрации 250 нМ производила небольшое и обратимое увеличение амплитуды вызванных ТПСТ (127 ± 4 % от базовых значений, p=0,047; n=5; рис. 3.4.7а). Увеличение ТПСТ было значительно больше когда апплицировался 1 μМ каината, причем этот эффект был более продолжительным, что может быть объяснено как медленным отмыванием вещества, так и активацией каких-то долговременных механизмов (рис. 3.4.7б). В этом случае, кратковременная депрессия (75 ± 11 %, p=0.08, n=5) предшествовала увеличению ТПСТ и накладывалась на раннюю фазу увеличения ответов. Эта депрессия совпадала со снижением входного сопротивления клеток и константы затухания ТПСТ (τ _{затухания}), полученной в результате моноэкспоненциальной аппроксимации снижения амплитуды синаптического тока после достижения им пика. Эти данные указывают на то, что ТПСТ шунтируются в результате увеличения тонической ГАМКергической проводимости. Феномен шунтирования токов за счет ГАМКергического тонического тока при аппликации каината был ранее описан для пирамидных клеток и связывается с активацией постсинаптических ГАМК_Арецепторов (Frerking et al. 1999). Основываясь на этих наблюдениях для избежания недооценки реальных амплитуд ТПСТ, мы сконцентрировали свое внимание на более поздних стадиях эффекта 1 µМ каината (>10 мин. от начала отмывки), когда амплитуда ТПСТ была максимально высокой (166 ± 17 %; p=0,016; n=5).

Опосредованное каинатом увеличение амплитуды ТПСТ сопровождалось незначительным изменением в соотношении амплитуд первого и второго ТПСТ в ответ на парную стимуляцию с интервалом 50 мс (рис. 3.4.7в; p=0,48; n=5). Однако,

Рис. 3.4.7 Аппликация каината увеличивает моносинаптические ТПСТ в интернейронах

а, Аппликация 250 нМ каината приводила к небольшому, но достоверному увеличению амплитуды ТПСТ (а₁). Оригинальные записи (верхний ряд, усреднение по 10 последовательным записям) были получены до, во время и после аппликации каината в одном интернейроне. Для усреднения использовались ТПСТ, нормированные к базовым значениям, с 5 интернейронов. Аппликация 250 нМ каината не производила значимого изменения ни во входном сопротивлении клеток (а₂), ни в коэффициенте затухания токов, полученном в результате моноэкспоненциальной аппроксимации затухания ТПСТ, (а₃, данные нормированные к базовым значениям).б, Когда апплицировался 1 μМ каината небольшое кратковременное повышение амплитуды ТПСТ предшествовало значительному снижению, за которым следовало большое и длительное увеличение амплитуды ТПСТ (б₁, n=5). Начальное снижение амплитуды токов коррелировало со снижением входного сопротивления (б₂) и константы затухания токов (б₃), указывая на эффект постсинаптического шунтирования. Оригинальные записи, представленные в верхнем ряду, в 5, 15 и 35 минут эксперимента с 250 нМ каината и в 5, 15, 35 и 70 минут с 1 μМ каината.в, Вызываемое каинатом увеличение ТПСТ сопровождалось незначительным изменением в коэффициенте парной стимуляции (в₁), указывая на отсутствие эффекта каината на вероятность высвобождения медиатора. Вставка: записи, нормированные к амплитуде первого ТПСТ, полученные с одного интернейрона, когда каинат произвел увеличение первого ТПСТ до 166 %. Увеличение амплитуды ТПСТ сопровождалось значительным увеличением вариабельности ответов (1/CV²,в₂), указывая на увеличение числа активных сайтов выброса медиатора.

вариабельность ответов, оцененная по статистическому параметру 1/CV², который меняется с квантовым содержанием (quantal content) (Edwards et al. 1989), значительно и пропорционально увеличивалась со средней амплитудой ТПСТ (рис. 3.4.7в; p=0,048; n=5). Эта ситуация (увеличение 1/CV²при отсутствии изменений в коэффициенте парной стимуляции) указывает на то, что увеличивается число сайтов высвобождения медиатора, а средняя вероятность высвобождения в функциональных сайтах не меняется. Такое происходит, например, когда увеличивается число пресинаптических терминалей, генерирующих потенциал действия в присутствии каината на ту же силу стимула.