3.1.3 Ионотропные гамКергические рецепторы как в интернейронах, так и пирамидных клетках чувствительны к агонисту гамкс рецепторов

Известно, что чувствительность к пикротоксину ГАМКергических рецепторов определяется наличием боковых цепочек аминокислот в сегменте M2, покрывающих внутреннюю часть канала, в частности, треонина разных субъединиц, находящегося в R⁶положении (Xu and Akabas 1996; Zhang et al. 1995a; Zhang et al. 1995b; Zhorov and Bregestovski 2000). Среди субъединиц ГАМКергических рецепторов грызунов только ρ₂имеют отличную аминокислоту в этом участке, что делает гомомерные и гетеромерные ρ₂-содержащие рецепторы относительно нечувствительными к пикротоксину (Greka et al. 1998; Zhang et al. 1995a). При этом, близкородственная ρ₁субъединица содержит треонин в R⁶положении и гомомерные рецепторы чувствительны к пикротоксину (Zhang et al. 2001). Возможно, в нашем исследовании сниженная чувствительность к пикротоксину связана с наличием в интернейрональном ГАМКергическом токе компонента, связанного с рецепторами содержащими ρ₂субъединицу. В таком случае, пикротоксин нечувствительные токи должны фармакологически отличаться от пикротоксин чувствительных. Это связано с тем, что ρ-содержащие рецепторы (ГАМК_С) имеют ряд отличий по отношению к агонистам, антагонистам и аллостерическим модуляторам классических ГАМК_Арецепторов. Показано, что ГАМК_Срецепторы принимают участие в ГАМКергической передаче в ретине, спинном мозге и superior colliculus (Bormann 2000b; Zhang et al. 2001). Известно, что нативные ГАМК_Cрецепторы в ретине также обладают сниженной чувствительностью к пикротоксину и низкой проводимостью одиночных каналов в сравнении с ГАМК_Арецепторами (Feigenspan et al. 1993). Однако, до настоящего времени не было показано роли ГАМК_Срецепторов в гиппокампе, не смотря на иммуноцитохимические данные, указывающие на наличие в нем РНК, кодирубщей ρ-субъединицы (Enz et al. 1995; Enz and Cutting 1999; Ogurusu et al. 1999; Wegelius et al. 1998).

В последнее время стали появляться доказательства того, что, по крайней мере, рекомбинантные ρ-субъединицы могут образовывать функциональные ГАМКергические рецепторы с γ₂субъединицами (Pan et al. 2000; Qian and Ripps 1999). Эти данные указывают на теоретическую возможность определенных отклонений ГАМКергических токов в гиппокампе от фармакологического профиля токов, опосредованных классическими ГАМК_Арецепторами. Иммуноцитохимические исследования также показали, что плотность γ₂субъединиц намного выше в интернейронах поля CA1, чем в пирамидных клетках (Sperk et al. 1997). Вместе взятые, эти данные указывают на то, что низкая чувствительность к пикротоксину в интернейронах, может объясняться комбинацией субъединиц ГАМКергических рецепторов, отличной от комбинации в классических ГАМК_Арецепторах.

Приняв во внимание сходство параметров ГАМКергических рецепторов интернейронов и ГАМК_Срецепторов (низкая чувствительность к пикротоксину и низкая проводимость одиночного канала), мы решили проверить на них эффект фармакологических агентов, специфичных для ГАМК_Срецепторов. Мы провели

ПК

Рис. 3.1.3 Генерализованная аппликация САСА (50 µМ) вызывает большие по амплитуде токи в пирамидных клетках, чем в интернейронах

а, Аппликация CACA (50 µМ), специфического агониста ГАМК_Срецепторов, производит увеличение тока компенсации в режиме фиксации потенциала как в интернейронах (), так и в пирамидных клетках (). Причем величина этого тока значительно выше в пирамидных клетках (ПК) - 153 ± 26 пА (n=5), чем в интернейронах (ИН) 55 ± 13 пА (n=4), p=0,02, t-тест (б).

аппликацию специфического агониста ГАМК_Срецепторов, цис‑аминокротоновой кислоты (CACA). Это вещество активирует рекомбинантные ГАМК_Срецепторы с K_d= 74 μМ и приблизительно в 130 раз менее эффективно для активации ГАМК_Арецепторов (Kusama et al. 1993). Необычным оказалось то, что аппликация низкой концентрации CACA (50 μМ, без пикротоксина) приводила к возникновению значительных по амплитуде токов как в интернейронах, так и пирамидных клетках (Рис. 3.1.3а). Неожиданным оказалось то, что величина тока была даже выше в пирамидных клетках, чем в интернейронах (55 ± 13 пА; n=4 в интернейронах; 153 ± 26 пА; n=5 в пирамидных клетках; p=0,02 t-тест между двумя типами клеток; Рис. 3.1.3б). Эти результаты указывают на наличие ГАМК_C-подобных рецепторов в обоих типах клеток и даже на более высокое их содержание в пирамидных нейронах. Однако, мы не стали сразу делать заключение о том, что полученный ток вызван ГАМК_Срецепторами. Существует предположение, что CACA может содержать небольшие количества (до 0,1 %) своего трансэнантиомера ТАСА (транс-аминокротоновой кислоты) – рацемическая смесь (Johnston 1996). TACA – более мощный агонист ГАМК_Арецепторов, чем CACA (Kusama et al. 1993). Возможно, что ток, который возникает при аппликации CACA, на самом деле, происходит от активации ГАМК_Арецепторов, опосредованной примесью ТАСА. Чтобы проверить это, мы апплицировали различные концентрации TACA. Низкая концентрация ТАСА (50 нМ), соответствующая ее содержанию 0,1 % в CACA (50 µМ) не вызвала никакого тока. Нам удалось получить сравнительно небольшой ток (2415 % от тока вызываемого аппликацией 50М CACA; n=5; p=0,03; Рис. 3.1.4а) только при концентрации TACA 2,5М, что соответствует 5 % от использованной концентрации CACA. Даже при аппликации TACA в концентрации 15М (33,3 % от САСА) нам не удалось получить тока, достигающего по величине ток, полученный при аппликации CACA (7211 % от CACA тока; n=5; p=0,03).

Таким образом, CACA вызывает значительный по величине ток в концентрации <1 % от K_dдля ГАМК_Арецепторов (9.7 мМ) (Kusama et al. 1993) и этот эффект не связан с содержанием в этом веществе TACA, более мощного агониста ГАМК_Арецепторов.

Другое возможное объяснение возникновения тока при аппликации CACA может быть связано с ее непрямым действием на ГАМК_Арецепторы. Было показано, что CACA вызывает высвобождение H³-ГАМК в срезах мозга при концентрации приблизительно в 10 выше, чем EC₅₀для ГАМК_Срецепторов (Chebib and Johnston 1997). Этот эффект был связан с ее влиянием на GAT3 (транспортер ГАМК) и исчезал при аппликации 100М‑аланина, блокатора данного транспортера.

Рис. 3.1.4 Ток, вызываемый аппликацией CACA, связан с прямой активацией ионотропных ГАМКергических рецепторов

а, Аппликации TACA 2,5 µМ () и 15 µM () производили меньшие по амплитуде токи, чем CACA 50 µМ ().а₁, Эффект аппликаций ТАСА и САСА на ток компенсации. Данные, полученные с одного нейрона. Ток компенсации до аппликации агонистов был приравнен к нулю (пунктирная линия)a₂, Данные, усредненные по нескольким клеткам. Ток, полученный при аппликации 2,5 µМ (Т2.5; 5% от концентрации CACA) составлял 24 ± 15 % (n=5), при аппликации 15 µМ (Т15; 33% от концентрации CACA) – 72 ± 11 % (n=5) от тока вызываемого CACA 50 µМ (С50). Эти данные выступают против гипотезы, что ток вызываемый аппликацией CACA (селективного агониста ГАМК_Срецепторов) связан с содержанием в веществе небольших концентраций (<0,1 %) стереоэнантиомера TACA, более эффективного агониста ГАМК_Арецепторов.б, Аппликация CACA 50 µМ в присутствии β-аланина 100 µМ (блокатора GAT3 – транспортера ГАМК) вызывала ток (), который не значительно отличался от CACA-тока при базовых условиях ().б₁, Эффект аппликаций на ток компенсации. Данные, полученные с одного нейрона. Ток компенсации до добавления β-аланина был приравнен к нулю (верхняя пунктирная линия). β-аланин сам по себе увеличивал ток компенсации (нижняя пунктирная линия).б₂, Усредненный по нескольким клеткам (n=5) СACA-опосредованный ток, полученный в присутствии 100 µМ β-аланина (β-ала) составил 98 ± 11 % от тока вызываемого CACA при базовых условиях (кон.). Эти данные выступают против гипотезы, что ток вызываемый аппликацией CACA связан с гетерообменом CACA/ГАМК при участии ГАМК транспортера GAT3.

Чтобы исключить непрямое действие САСА через ГАМК транспортер, мы провели ее аппликацию в присутствии 100 М‑аланина.‑аланин сам по себе приводил к возникновению входящего тока (Рис. 3.1.4б). Возникновение этого тока может объясняться как блокадой обратного захвата (uptake) ГАМК, так и прямым агонистическим действием‑аланина на глициновые рецепторы. В этих условиях аппликация CACA (50М) также приводила к возникновению тока, незначительно отличающегося от тока без‑аланина (9811 % - ток в присутствии‑аланина от тока без него; n=5; p=0,8). Таким образом, аппликация CACA активировала ГАМКергические рецепторы прямо, а не через накопление ГАМК, влияя на транспортер GAT3. Этот результат указывает на наличие как в интернейронах, так и пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа тока, чувствительного к агонистам ГАМК_Срецепторов.

Таким образом, нами впервые была продемонстрирована фармакологическая активность агониста ГАМК_Срецепторов в гиппокампе. Однако, в этих экспериментах нам не удалось объяснить различную чувствительность интернейронов и пирамидных клеток к пикротоксину. Для ответа на этот вопрос, мы решили проверить, каким образом ГАМКергические токи в интернейронах и пирамидных клетках будут модулироваться аллостерическими модуляторами ГАМК_Арецепторов.