Введение

Актуальность проблемы

Соотношение тормозной и возбуждающей систем нейропередачи в центральной нервной системе закладывает основу для обработки и сохранения информации мозгом. Нарушение этого баланса приводит к развитию ряда нейродегенеративных заболеваний, в частности эпилепсии. Не смотря на длительную историю изучения тормозных и возбуждающих нейронов, синаптической передачи между этими клетками и механизмов ее модуляции, достигнуто сравнительно немного в направлении излечения патологических состояний мозга.

Использование современных методов, технологий и достижений фармакологии позволило, тем не менее, сделать определенный успех в данной проблематике. В частности, описаны основные типы рецепторов глутамата и ГАМК, главных возбуждающего и тормозного медиаторов головного мозга (Barnard et al. 1998; Chen et al. 2001). Идентифицированы основные возбуждающие и тормозные пути синаптической передачи. При этом, казалось бы, логичная синаптическая модель построения мозга оказалась недостаточной, для того чтобы реалистично описать функционирование системы в целом.

Таким образом, задачей современной науки стала детализация и уточнение функциональных изменений в синаптической передаче и возбудимости нервных клеток. Для этого проводятся исследования субъединичного состава рецепторов и поиск специфических активных веществ (блокаторов, активаторов, аллостерических модуляторов этих рецепторов); биохимических каскадов, запускаемых активацией рецепторов; особенностей высвобождения, поглощения и синаптического/внесинаптического действия нейропередатчиков; интеграции и взаимодействия различных систем нейропередатчиков. Так было показано, что ГАМКергические рецепторы, являясь пентомерами, имеют различную субъединичную (субъединиц насчитывается, по современным данным, 18 классов) комбинацию в зависимости от типа и локализации нейрона. Логично предположить, что подобная гетерогенность рецепторов определяет высокую клеточную и синаптическую специфичность ГАМКергического торможения в мозге при использовании одного и того же эндогенного агониста (ГАМК). На практике это означает, что эффективность торможения будет зависеть не только от числа тормозных терминалей на клетке и не только от их способности эффективно высвобождать медиатор, но и от того, как постсинаптическая клетка на него будет реагировать.

С другой стороны, современные иммуноцитохимические и электрофизиологические исследования показали, что расположение рецепторов различных нейропередатчиков и эффект их активации не ограничивается лишь локальным постсинаптическим участком (Isaacson 2000; Soltesz and Nusser 2001; Vizi and Kiss 1998). Внесинаптические рецепторы могут находиться на соме, дендритах и, даже, аксоне клетки. Роль этих рецепторов привлекает значительное внимание и остается до конца не изученной. Предполагается, что внесинаптические рецепторы являются своего рода “детекторами” внеклеточной концентрации медиаторов и специфически балансируют возбудимость клеток. Например, при эпилептиформной активности или нарушении обратного захвата медиаторов концентрация глутамата и ГАМК возрастает в межклеточном пространстве (Kullmann 1999). В этом случае, клетки содержащие внесинаптические возбуждающие и/или тормозные рецепторы будут менять свою возбудимость в соответствии с этим увеличением. Такие изменения, в зависимости от их интенсивности и типа клетки, на которую они воздействуют (это может быть тормозный интернейрон или возбуждающий нейрон), будут иметь эпилептогенный или, наоборот, антиэпилептогенный эффект.

Одной из структур мозга, обладающей повышенной чувствительностью к эпилептогенезу, является гиппокамп, клеточная организация которого довольно хорошо изучена (Freund and Buzsaki 1996; Vizi and Kiss 1998). Тем не менее, остается до конца не ясным, какие механизмы вовлекаются на уровне разных типов клеток в эпилептиформную активность. До последнего времени бытовал упрошенный взгляд на соотношение тормозной и возбуждающей передачи в этой структуре. Основные возбуждающие связи были представлены глутаматергическими гранулярными клетками зубчатой фасции и пирамидными клетками полей СА1-СА3 и субикулюма. Тормозная система представлялась ГАМКергическими интернейронами, диффузно расположенными в ткани и имеющими моносинаптические контакты с возбуждающими клетками. Такая схема не могла объяснить полностью все эффекты на клеточном уровне, которые возникали при эпилепсии. Представление о сложности синаптических связей в сети интернейронов, когда торможению подвергаются не только возбуждающие клетки, но и сами интернейроны, позволило расширить наши представления об обработке сигнала и патогенезе в гиппокампе. Принимая во внимание, всевозможные внесинаптические события и клеточную специфичность рецепторов нейропередатчиков, открылось целое направление исследований, которое может привести к более глубокому пониманию процессов обработки информации в мозге и разработке специфически действующих лекарственных препаратов, высокоэффективных при том или ином нейродегенеративном заболевании. Этому направлению исследований и посвящена представленная диссертационная работа.

Научная новизна

1. В представленной работе, впервые, показано наличие в гиппокампе ГАМКергических рецепторов с характерной для ГАМК_Сфармакологией. Прежде считалось, что эти рецепторы находятся в основном в ретине.

2. В интернейронах гиппокампа описан ГАМКергический ток, опосредованный рецепторами, которые не могут быть отнесены ни одному из известных типов ГАМКергических рецепторов. Их фармакологический профиль совмещает в себе свойства как ГАМК_А, так и ГАМК_Срецепторов. Эти рецепторы клеткоспецифичены и не обнаружены в пирамидных нейронах.

3. Впервые показано, что в гиппокампальных интернейронах, но не пирамидных клетках, при обычных условиях помимо фазического торможения (ГАМКергических ТПСТ) существует пикротоксин-чувствительный тонический ток, опосредованный ионотропными ГАМКергическими рецепторами.

4. Увеличение внеклеточной концентрации ГАМК приводит к возникновению тонического тока как в интернейронах, так и в пирамидных клетках. Этот ток отличается по фармакологическим свойствам от базового тонического тока в интернейронах.

5. Впервые представлено электрофизиологическое доказательство наличия глутаматергических метаботропных рецепторов в тормозных ГАМКергических синапсах интернейронов, но не пирамидных клетках поля СА1 гиппокампа. Эти рецепторы (относящиеся к группе III) активируются спилловером глутамата с соседних глутаматергических синапсов и снижают вероятность выброса ГАМК.

6. Представлено доказательство того, что метаботропные ГАМК_Bрецепторы, находящиеся на тормозных терминалях интернейронов могут активироваться за счет спилловера ГАМК с соседних терминалей.

7. Впервые показано наличие каинатных рецепторов в аксонах интернейронов гиппокампа. Активация этих рецепторов за счет спилловера глутамата с возбуждающих терминалей снижает порог генерации потенциалов действия в аксонах интернейронов.

8. Блокада NMDA рецепторов, модулирующих глутаматергическую передачу, снижает, но не достаточна, чтобы подавить пачечную активность в срезах гиппокампа.

9. Блокада L-типа потенциал-зависимых кальциевых каналов (изменяющих возбудимость клеток и модулирующих ГАМКергическую передачу) полностью подавляет пачечную активность.

Научно-практическая значимость исследования

1. Данные, полученные в данной работе, дают более глубокое понимание структуры взаимосвязей между различными формами ионотропных ГАМКергических рецепторов и создают предпосылку для внесения изменений в их классификацию.

2. Клеточная специфичность распределения ГАМКергических рецепторов, тонического торможения, модулирующих влияний метаботропных и каинатных рецепторов на тормозную передачу создает возможность создания ряда препаратов (или их комбинаций) селективно влияющих как на возбудимость нейрональной сети в целом, так и отдельных синаптических путей. Это может быть использовано, в частности, для создания препаратов с выраженным антиэпилептическим действием и отсутствием побочных эффектов.

3. Разработанная модель пачечной активности in vitro может быть применена как для исследования фундаментальных основ формирования ритмов, так и иссследования эпилептиформной активности.

4. Результаты представленной работы вошли в курс лекций читаемых студентам медицинского факультета University College London (Лондон, Великобритания) и в курсы повышения квалификации врачей и научных сотрудников National Hospital of Neurology (Лондон, Великобритания).

5. Результаты представленной работы подготовлены для главы Synaptic Function учебника по Нейробиологии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Традиционная классификация разделяет ионотропные ГАМКергические рецепторы на два типа ГАМК_Аи ГАМК_С. В представленной работе в интернейронах гиппокампа нами обнаружена форма ГАМКергического рецептора, совмещающего свойства как ГАМК_А, так и ГАМК_Срецепторов.

2. Отсутствие диапазона пластических изменений, характерных для глутаматергических синапсов, в ГАМКергических синапсах компенсируется разнообразием и синаптической специфичностью рецепторов этого медиатора. Нами показано, что фармакологические свойства ГАМКергических рецепторов различны в интернейронах и пирамидных клетках.

3. В гиппокампе помимо фазического торможения (ТПСТ), опосредованного ГАМКергическими рецепторами, существует ГАМКергическое тоническое торможение. При базовых условиях это торможение наблюдается только в интернейронах. При повышении внеклеточной концентрации ГАМКергический тонический ток регистрируется как в интернейронах, так и пирамидных клетках. Причем, тоническая проводимость, связанная с повышением внеклеточной концентрации ГАМК, фармакологически отличается от тонической проводимости при базовых условиях в интернейронах.

4. Глутаматергические метаботропные рецепторы группы IIIрасполагаются в пресинаптическом звене тормозных ГАМКергических синапсов на интернейронах, но не на пирамидных клетках. Активация этих рецепторов за счет спилловера глутамата с возбуждающих синапсов снижает выброс ГАМК.

5. Глутаматергические каинатные рецепторы располагаются на аксонах интернейронов и при активации за счет спилловера глутамата с возбуждающих синапсов снижают порог генерации потенциалов действия в этих аксонах.

6. Са²⁺ток, опосредованный NMDA рецепторами, регулирующими глутаматергическую передачу, влияет, но не является необходимым для развития пачечной активности в поле СА1 срезов гиппокампа. Пачечная активность в использованной модели зависит от Са²⁺тока, опосредованного L-типом потенциал-зависимых кальциевых каналов, изменяющих возбудимость клеток и модулирующих ГАМКергическую передачу.