Культивирование вирусов в культурах клеток.

Культура клеток – это клетки многоклеточных организмов (человека, животных), живущие и размножающиеся in vitro. Подразделяются на:

• первичные (неперевиваемые);

• полуперевиваемые;

• перевиваемые.

Первичные (неперевиваемые) культуры клеток – клетки, полученные непосредственно из органов и тканей организма (почек, легких, кожи, тимуса, тестикул эмбриона человека или молодых животных).

Этапы приготовления первичных культур клеток:

• выделение органа/ткани;

• измельчение и гомогенизация ткани до частиц размером 2-4 мм;

• разъединение клеток путем трипсинизации;

• внесение в пробирку (флакон, матрас) с питательной средой (среда 199, Игла);

• инкубирование в термостате – клетки начинают делиться до покрытия поверхности стекла в один слой и прекращают размножаться (контактное торможение).

Первичные культуры клеток живут ≈ 7-21 день, при пересевах меняют форму и гибнут.

Полуперевиваемые культуры клеток – диплоидные клетки человека, выдерживающие до 50- 100 пассажей (после перевивания в новую пробирку со свежей питательной средой вновь начинают размножаться до образования монослоя).

Перевиваемые культуры клеток – это клетки, способные к размножению вне организма неопределенно длительное время (злокачественные/опухолевые клетки с гаплоидным набором хромосом, выдерживающие бесконечное количество пассажей): например, HeLa – клетки рака шейки матки (получены от женщины, умершей в 1956 г.), Нep-2 – клетки карциномы гортани и др.

Методы индикации вируса в культуре клеток:

1. цитопатическое действие (ЦПД) вируса на клетки – дегенеративные морфологические изменения клеток (мелкозернистое перерождение, округление, фрагментация, образование симпластов);

2. образование вирусом специфических внутриклеточных включений;

3. бляшкообразование (феномен Дальбекко) – образование в монослое клеток

«стерильных пятен» (бляшек – деструктивные клетки, разрушенные вирусом и неспособные окрашиваться красителем нейтральным красным (количество бляшек соответствует количеству вирусных частиц);

4. цветная проба Солка – сохранение первоначального цвета среды (красного) при наличии вируса, тогда как активные незараженные вирусом клетки метаболизируют и изменяют цвет среды (желтый);

5. РГА с культуральной жидкостью;

6. реакция гемадсорбции (РГадс) – адсорбция эритроцитов на поверхности пораженной вирусом клетки;

7. феномен интерференции (используется для обнаружения вирусов, не оказывающих ЦПД и не вызывающих гемагглютинацию) – в зараженную материалом культуру клеток вносят индикаторный вирус (ВВС – вирус везикулярного стоматита) с известным ЦПД (симпластобразование) – при наличии в культуре клеток исследуемого вируса индикаторный вирус ЦПД не окажет (клетка может поражаться только одним вирусом).

Достоинства – получение максимальной концентрации вируса. Недостатки – не все вирусы культивируются в культуре клеток.