Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций.

С целью диагностики вирусных инфекций применяются следующие методы:

• Вирусоскопический – обнаружение в исследуемом материале вирусов с помощью световой (крупные вирусы, внутриклеточные включения вирусов), люминесцентной и электронной микроскопии;

• Вирусологический – выделение вирусов из исследуемого материала с последующей их идентификацией (установление вида и типа вируса посредством серологических реакций);

• Серологический – обнаружение в исследуемом материале антигенов вирусов или вирусоспецифических антител;

• Биологический – заражение вируссодержащим материалом лабораторных животных;

• Молекулярно-биологический – выявление в исследуемом материале нуклеиновых кислот вирусов (ПЦР, ДНК-зонды);

• Экспресс-методы – выявление антигенов вирусов в короткие сроки (РИФ);

• Аллергологический – выявление ГЗТ к вирусу.

Этапы вирусологического метода исследования:

1. Взятие материала (выбор материала определяется клиническими признаками заболевания, местом размножения вируса в организме и путями его выделения), транспортировка в лабораторию и подготовка к исследованию (для подавления сопутствующей бактериальной флоры обрабатывают антибиотиками).

2. Заражение исследуемым материалом чувствительной модели. Вирусы в отличии от бактерий не растут на питательных средах, т.к. являются абсолютными (облигатными) паразитами, поэтому для их культивирования применяются особые модели:

• в организме восприимчивых животных;

• в куриных эмбрионах (овокультуры);

• в культуре клеток.

3. Культивирование вируса в зараженной модели при стандартных условиях (оптимальная температура, продолжительность культивирования).

4. Индикация (обнаружение) вируса в зараженной модели.

5. Идентификация выделенного вируса в серологических реакциях. Достоинство вирусологического метода – 100% достоверность.

Культивирование вирусов в организме чувствительных животных – на первом этапе развития вирусологии был единственным методом, доказывающим наличие фильтрующихся агентов в исследуемом материале.

Требования, предъявляемые к лабораторным животным:

• животное должно быть чувствительным к данному вирусу;

• использование новорожденных/молодых особей;

• использование инбридных (беспородных) животных/гнотобионтов (выращены в безмикробной среде);

• использование здоровых животных одной линии (одного пола, возраста, веса, содержащихся в одинаковых условиях).

Способ заражения животных определяется тропизмом вируса (способностью репродуцироваться в определенных типах клеток):

• нейротропен (например, вирус бешенства) – вводится интрацеребрально;

• пневмотропен (например, РС-вирусы) – интраназально;

• дерматропен (например, вирус натуральной оспы) – внутрикожно;

• пантропен – внутривенно/внутрибрюшинно.

Методы индикации вируса в организме лабораторного животного:

1. клинические симптомы заболевания;

2. гибель животного;

3. патоморфологические изменения органов при вскрытии.

Достоинства – выделение тех вирусов, которые не культивируются в куриных эмбрионах и культурах клеток.

Недостатки – контаминация животных посторонними микроорганизмами.

Культивирование вирусов методом овокультур – заражение вирусами куриных эмбрионов.

Требования, предъявляемые к куриным эмбрионам:

• должны быть из эпидемиологически благополучных хозяйств;

• скорлупа должна быть чистой, непигментированной, без механических повреждений;

• возраст – 5-12 дней (недостаточно противовирусных ингибиторов). Способы заражения куриных эмбрионов:

• закрытый (прокол иглой под контролем овоскопа);

• открытый (с удалением части скорлупы).

Исследуемый материал вводят в аллантоисную и амниотические полости, хорион- аллантоисную оболочку и желточный мешок. Перед заражением скорлупу над воздушной камерой обрабатывают 70% этиловым спиртом и фломбируют (обжигают на пламени). После заражения отверстие в скорлупе заливают расплавленным парафином. Инкубируют при 35-37⁰С ≈ 48 часов.

Методы индикации вируса в куриных эмбрионах:

1. результаты овоскопии – отсутствие подвижности эмбриона, слабая инъецированность сосудов кровью и отсутствие их пульсации;

2. паталогоанатомические изменения на хорион-аллантоисной оболочке – отечность, кровоизлияния, наличие оспинок (узелков);

3. отставание эмбриона в росте и развитии, пороки развития, гибель;

4. положительная реакция гемагглютинации (РГА) – через 5-10 минут при смешивании аллантоисной жидкости и суспензии эритроцитов (кур, гусей, уток, морских свинок и других животных) на дне лунки полистеролового планшета образуется осадок в виде «перевернутого зонтика» вследствие склеивания эритроцитов под действием вируса (отрицательная РГА – эритроциты не склеиваются и выпадают в осадок в виде «пуговки»).

Достоинства – высокая чувствительность к большому спектру вирусов. Недостатки – обнаружение вируса только после вскрытия эмбриона.