Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Основы микроб ГУсЭ.doc
Скачиваний:
34
Добавлен:
11.11.2019
Размер:
916.99 Кб
Скачать

Диско-диффузионный метод

Метод основан на способности антибиотика диффундировать из пропитан-ных ими бумажных дисков в питательную среду, угнетая рост микроорганиз-мов, посеянных на поверхности агара.

Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изго-товителя. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанав-ливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Соблюдение указанных предосторожностей необхо-димо в связи с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глу-бины и равномерности агарового слоя.

При использовании свежеприготовленных чашек или чашек после хранения в холодильнике их необходимо подсушить перед инокуляцией, что достигается инкубацией при 35 0С с приоткрытой крышкой в течение 10-20 мин. Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.

Для определения чувствительности следует использовать только стандарти-зированные качественные диски. При определении чувствительности диско-диффузионным методом используют стандартный инокулюм, соответствующий по плотности 0,5 по стандарту Мак-Фарланда и содержащий примерно 1,5х108 КОЕ/мл. Инокулюм следует использовать в течение 15 мин. после приготовления. Стандартный инокулюм наносят пипеткой на поверхность чашки Петри с питательной средой в объеме 1-2 мл, равномерно распределяют по поверхности покачиванием, после чего удаляют избыток инокулюма пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 мин.

Не позднее, чем через 15 мин. после инокуляции на поверхность питательной среды наносят диски с антибиотиками. Аппликацию дисков проводят с помощью стерильного пинцета или автоматического диспенсера. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Таким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с антиби-отиком. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

Непосредственно после аппликации дисков чашки Петри помещают в термостат кверху дном и инкубируют при температуре 35оС в течение 18-24 ч. (в зависимости от вида тестируемого микроорганизма).

После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную ма-товую поверхность так, чтобы свет падал на них под углом в 450 (учет в отра-женном свете). Диаметр зон задержки роста измеряют с точностью до 1 мм (рис.14).

Рисунок 14. Диско-диффузионный метод

При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на зону полного подавления видимого роста. Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны подавления роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры.

Фитонциды

Антибиотические вещества вырабатываются не только мик­роорганизма-ми, но также растениями и животными. Фитонциды – это вещества, выделяемые растениями и обладающие антимикробным действием. Химическая природа фитон­цидов разнообразна. Антимик­робным действием обладают многие вещества, находящиеся в растениях: эфирные масла, гликозиды, антоцианы, дубильные вещества и многие другие, хими­ческая природа которых еще не раскрыта.

Антимикробными свойствами обладают многие употребляе­мые в пищу овощи, пряности. Из чеснока и некоторых сортов репчатого лука выделен аллицин, из репы и редьки — рапин, из томатов — томатин. Эти вещества активны в отношении раз­личных бактерий.

Для изучения действия фитонцидов на бактерии можно воспоьзоватося диско-диффузионным методом, помещая на по-верхность питательной среды вместо дисков небольшое количество измельчён-ного растительного материала (натёртый на тёрке чеснок).

После термостатирования при температуре 37 0 С выявляют действие фитон-цидов чеснока на исследуемые бактерии. Устанавливают вокруг кашицы чес-нока наличие «серильной зоны» - зоны отсутствия роста бактерий и зоны угне-тения (несплошной, рассеянный рост колоний).

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

  1. Антибиотики. Классификация антибиотиков по химическому составу, по источнику получения, по механизму действия, по спектру действия.

  2. Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

  1. Поставить опыт по определению чувствительности кишечной палочки и культуры пекарских дрожжей к УФ-излучению.

  2. Поставить опыт по определению чувствительности кишечной палочки к различным антибиотикам методом дисков.