Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Основы микроб ГУсЭ.doc
Скачиваний:
34
Добавлен:
11.11.2019
Размер:
916.99 Кб
Скачать

Изучение действия уф-света на микроорганизмы

Среди разнообразных видов излучения, применяемых в качестве инактивирующих и мутагенных агентов, наиболее часто используются ультрафиолетовые и ионизирующие лучи, различающиеся между собой длиной волны. В диапазоне от 4000 до 10 Å говорят об ультрафиолетовых лучах, а в диапазоне от 10 до 0,1 Å – об ионизирующем излучении. УФ-свет и ионизирующее излучение поглощаются ДНК клетки, в которой они вызывают различные нарушения. Ионизирующие излучения индуцируют в молекулах ДНК одно- и двунитевые разрывы углеводно-фосфатных цепей и изменения азотистых оснований. Основными фотопродуктами в ДНК после действия УФ-лучей являются циклобутановые димеры тиминовых оснований, располагающиеся в одной нити. Наибольший летальный эффект УФ-лучей наблюдается при длине волны 260 нм, при которой отмечается максимум поглощения УФ-лучей молекулами ДНК.

При определении чувствительности бактерий к УФ-облучению 0,1 мл 18-часовой бактериальной культуры, выращенной в жидкой питательной среде, засевают с помощью шпателя на поверхность полноценной агаризованной среды в чашке Петри. После этого на поверхность среды помещают диск плотной бумаги в качестве экрана, защищающего клетки бактерий от воздействия УФ-лучей. Облучение проводят в открытых чашках Петри с помощью бактерицидной лампы ДБ-15 в течение 3 мин на расстоянии 40 см. По окончании облучения стерильным пинцетом снимают диск бумаги, чашки Петри закрывают и помещают в термостат для инкубирования при оптимальной температуре. При учете результатов отмечают, что культура чувствительна к УФ-свету, если сплошной рост наблюдается только в зоне помещенного диска, на остальной поверхности среды в чашке – единичные колонии или полное отсутствие роста.

Образование антибиотических веществ

В процессе жизнедеятельности многие микроорганизмы образуют специ-фические продукты, которые обладают высокой физиологической активностью по отношению к другим микрорганизмам и вирусам, задерживая их рост или убивая их. Они называются антибиотиками. В промышленных масштабах антибиотики получают путём биосинтеза микроорганизмами-продуцентами и полусинтетически, трансформируя химическим путем молекулы природных антибиотиков. Знание химического строения природных антибиотиков позволяет получать некоторые из них, например левомицетин, путем химического синтеза. Антибиотики обладают способностью убивать или тормозить рост и развитие микроорганизмов. В связи с этим различают бактериостатическое и бактерицидное действие антибиотиков. В отношении противогрибковых антибиотиков говорят о их фунгистатической и фунгицидной активности.

Многими исследователями показана эффективность примене­ния антибиотиков для задержки микробной порчи скоропортя­щихся пищевых продуктов, особенно в сочетании с холодом.

Разрешается использование лишь некоторых антибиотиков (нистатина и биомицина) и только в ограниченных случаях (например, при транспортировании на дальние расстояния) для сырых продуктов (мясо, рыба), которые в последующем сохра­няются на холоде. Допустимое содержание антибиотиков в про­дукте строго регламентируется, и требуется полное разрушение его в процессе обычной тепловой кулинарной обработки.

Для количественного выражения биологической активности вещества введено понятие единицы действия (ЕD). За единицу действия антибиотика принимают минимальное количество вещества, которое задерживает рост и стандартного штамма микроорганизма в строго определенных условиях. Для большинства антибиотиков 1 ЕD соответствует 1 мкг химически чистого препарата.

Современные методы определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам делят на методы серийных разведений и диффузионные методы.

Методы серийных разведений основаны на определении основного коли-чественного показателя, характеризующего микробиологическую активность антибиотика − величины его минимальной подавляющей концентрации (МПК), то есть минимальной концентрации, подавляющей рост исследуемого микро-организма. Для этого заданные концентрации антибиотика вносят в питатель-ную среду, которую затем засевают культурой исследуемого микроорганизма, и после инкубации оценивают наличие или отсутствие видимого роста.

В зависимости от характера используемой питательной среды различают методы серийных разведений в агаре или в бульоне. В зависимости от объема используемой жидкой питательной среды выделяют методы серийных макро- и микроразведений.

Диффузионные методы определения чувствительности основаны на диф-фузии антибиотика в плотной питательной среде и подавлении роста ис-следуемой культуры в той зоне, где концентрация антибиотика превосходит МПК.

В диско-диффузионном методе в качестве носителя антибиотика используют бумажный диск. Образование зоны подавления роста происходит в результате диффузии антибиотика из носителя в питательную среду. Величина диаметра зоны подавления роста обратно пропорциональна МПК.

Для оценки чувствительности необходимо использовать только специально предназначенные для этой цели среды (Мюллера − Хинтона, АГВ и др.).

Вид питательной среды для оценки чувствительности определяется выбран-ным методом проведения исследования (агар или бульон), а также видом тес-тируемого микроорганизма. Выбранная питательная среда для определения чув-ствительности готовится из сухой среды промышленного производства в со-ответствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования питательную среду сразу же разливают в стерильные пробирки или в чашки Петри, или (если необходимо) колбы со средой помещают на водяную баню при 48–500С, где вы-держивают до достижения указанной температуры, после чего в них асепти-чески вносят термолабильные питательные добавки и/или рабочие растворы антибиотиков, а затем разливают в пробирки или в чашки Петри.

Агар разливается по чашкам слоем 4 мм (на чашку диаметром 100 мм требуется 25 мл агара, на чашку диаметром 90 мм − 20 мл). Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным обра-зом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допускается хра-нение в запаянных полиэтиленовых пакетах в холодильнике при 4-8 0С в тече-ние недели.

Приготовление суспензии (инокулюма) исследуемой культуры

Концентрация бактерий должна составлять 1,5108 КОЕ/мл. Оптическая плотность бактериальной суспензии с данной концентрацией соответствует стандарту мутности 0,5 по Мак-Фарланду. Существуют коммерчески доступные стандарты мутности и спектрофотометры.

Приготовление суспензии из агаровой культуры

Отбирают несколько однотипных, четко изолированных колоний, выросших на неселективных плотных питательных средах. Петлей переносят незначи-тельное количество материала с верхушек колоний в пробирку со стерильным физиологическим раствором или питательным бульоном, доводя плотность до 0,5 по стандарту Мак-Фарланда. Приготовленную суспензию следует исполь-зовать в течение 15 мин. после приготовления.

Приготовление суспензии из бульонной культуры

Можно использовать 5-6-часовую бульонную культуру микроорганизма. Для этого отбирают несколько однотипных изолированных колоний, петлей переносят незначительное количество материала в пробирку с 5,0 мл жидкой неселективной питательной среды. Инкубируют при 35 0С. Примерно через 5-6 ч. инкубации плотность микробной суспензии приблизительно соответствует необходимой, и ее точно доводят до 0,5 по Мак-Фарланду путем добавления стерильного бульона или физиологического раствора.