Санитарно-микробиологическое исследование воды
Вода и почва, является естественной средой обитания разнообразных бактерий, грибов, вирусов, микроскопических водорослей, простейших. В водоемах различают собственную (аутохтонную) и заносную (аллохтонную) микрофлору, поступающую из почвы, воздуха, живых организмов. В воде, как и в почве, происходят биологические процессы очищения от несвойственной (аллохтонной) микрофлоры.
Концентрация водных микроорганизмов определяется содержанием в воде органических веществ. Наиболее чисты грунтовые подземные воды, так как после просачивания через почву большинство микробов задерживается в фильтрующем слое. Значительно больше микробов в открытых водоемах, что связано с высоким содержанием растворенных питательных органических веществ, которые поступают со сточными и канализационными водами, отходами предприятий. Вода имеет важное санитарно-эпидемиологическое значение как фактор передачи возбудителей многих инфекций, особенно кишечных, которые с испражнениями больных и носителей поступают в открытые водоемы, а оттуда нередко — и в питьевую воду.
Споры возбудителя сибирской язвы годами могут сохраняться в воде; месяцы переживают в воде сальмонеллы, лептоспиры, вирусы полиомиелита и гепа-
тита А, меньше (дни, недели) выживают возбудители дизентерии, холеры, бру-целлеза, туляремии, условно-патогенные энтеробактерии. В теплое время года благодаря большей активности процессов самоочищения воды продолжитель-ность жизни бактерий короче, в холодной воде, соответственно, дольше. Во льду возбудители кишечных инфекций могут сохраняться в течение нескольких недель и месяцев.
Санитарно-микробиологическое исследование воды проводится с целью теку-щего надзора, то есть в плановом порядке, а также по специальным эпидемио-логическим показаниям.
Требования к качеству воды разных объектов, методы исследований и крите-рии оценки результатов представлены в нормативных актах – государственных стандартах (ГОСТ), санитарных правилах и нормах, методических указаниях.
Основными официально регламентированными показателями качества сани-тарно-микробиологического состояния воды в настоящее время являются:
общее микробное число (ОМЧ);
наиболее вероятное число колиформных бактерий;
наиболее вероятное число термотолерантных колиформных бактерий;
наличие спор сульфитредуцирующих клостридий;
количество бляшкообразующих единиц (БОЕ) бактериофага E.coli.
При необходимости расследования водных вспышек инфекционных заболе-ваний проводят более детальное санитарно-микробиологическое исследование воды, определяя наличие энтерококков, сальмонелл, холерного вибриона, энтеровирусов.
Для отбора проб воды используют специально предназначенную для этих целей одноразовую посуду или емкости многократного применения, изготовленные из материалов, не влияющих на жизнедеятельность микроорганизмов. Емкости должны быть оснащены плотно закрывающимися пробками.
Отбор проб из крана производят после предварительной его стерилизации обжиганием и последующего спуска воды не менее 10 мин при открытом кране. Пробу отбирают непосредственно из крана без резиновых шлангов, водораспределительных сеток и других насадок.
При отборе хлорированной воды в емкость до ее стерилизации вносят серноватистокислый натрий из расчета 18 - 20 мг на 500 см3 пробы сточной воды.
При заполнении емкостей должно оставаться пространство между пробкой и поверхностью воды, чтобы пробка не смачивалась при транспортировании. Срок начала исследований от момента отбора проб не должен превышать 6 ч.
Определение общего микробного числа
Метод определяет в питьевой воде общее число мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов (ОМЧ), способных образовывать колонии на питательном агаре при температуре 37 °С в течение 24. Исходную пробу воды титруют проводят до разведения 1:1000000, то есть 10-6 .
Из каждого разведения делают посев не менее двух объемов по 1 мл в стерильные чашки Петри, слегка приоткрывая крышки. После внесения воды в каждую чашку вливают (8—12) мл (на чашку диаметром 90—100 мм) расплавленного и остуженного до (45—49) °С питательного агара после фламбирования края посуды, в которой он содержится. Затем быстро смешивают содержимое чашек, равномерно распределяя по всему дну, избегая образования пузырьков воздуха, попадания агара на края и крышку чашки. Эту процедуру производят на горизонтальной поверхности, где чашки оставляют до застывания агара. После застывания агара чашки с посевами помещают в термостат вверх дном и инкубируют при температуре 37°С в течение 24 ч. Подсчитывают все выросшие на чашке колонии, наблюдаемые при увеличении в 2 раза. Учитывают только те чашки, на которых выросло не более 300 изолированных колоний. Количество колоний на обеих чашках суммируют и делят на два. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл исследуемой пробы воды ( см. формулу 6.3).
Если на одной из 2 чашек подсчет невозможен, результат выдают на основании учета колоний на одной чашке. Если на двух чашках имеет место рост расплывчатых колоний, не распространяющийся на всю поверхность чашки, или выросло более 300 колоний и анализ нельзя повторить, подсчитывают сектор чашки с последующим пересчетом на всю поверхность.
Определение числа бактерий группы кишечных палочек (колиформных бактерий)
При исследовании питьевой воды из системы централизованного водоснабжения анализируют 333 мл, профильтровывая этот объем не менее чем через два фильтра. При исследовании питьевой воды децентрализованного водоснабжения анализируют не менее 100 мл воды. Каждую пробу воды профильтровывают не менее чем через три фильтра (например, можно фильтровать по 100, 10 и 1 мл). Объемы воды для посева выбраны правильно, если на 1 - 2-х фильтрах выросли изолированные колонии, среди которых не более 30 колоний относятся к бактериям группы кишечных палочек.
Для фильтрования используют мембранные фильтры со средним диаметром пор 0,45 мкм и размером 35 или 47 мм в диаметре (отечественные фильтры «Владипор» МФАС–0С–1, МФАС–0С–2, МФАС–МА (№ 4–6) или зарубежные — ISO 9000 или EN 29000)., прибор для фильтрования под вакуумом с диаметром фильтрующей поверхности 32 мм и с приспособлением для создания вакуума.Сухие стерильные мембранные фильтры перед фильтрованием смачивают в стерильной дистиллированной воде. Фильтры помещают на среду Эндо и термостатируют
при (37 ± 2) °С в течение 18 - 24 ч.
При отсутствии какого-либо роста на фильтрах или при наличии только пленчатых, губчатых с неровной поверхностью и краями, плесневых и других не характерных для кишечных палочек колоний дают отрицательный ответ. Анализ на этом заканчивают через 18 - 24 ч.
При росте на фильтрах колоний, характерных для кишечных палочек (темно-красных с металлическим блеском и без него, красных, розовых слизистых, розовых с темным центром, бесцветных) выполняют оксидазный тест. Мембранный фильтр колониями вверх переносят на кружок фильтровальной бумаги, смоченной реактивом для определения оксидазной активности. Учитывая бактерицидность реактивов для определения оксидазной активности, мембранный фильтр сразу после проявления реакции следует перенести обратно на среду Эндо и не позднее 5 - 7 мин пересеять оксидазоотрицательные колонии в полужидкую среду с глюкозой (если это необходимо по дальнейшему ходу анализа). Наличие активной оксидазы (изменение цвета колоний на сине-фиолето-вый) у всех колоний, за исключением не характерных для БГКП, позволяет дать отрицательный ответ и закончить анализ через 18 - 24 ч.
Если выросли колонии, не обладающие оксидазной активностью, то из нескольких колоний каждого типа готовят мазки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Отсутствие в мазках грамотрицательных, не образующих спор палочек, позволяет дать отрицательный ответ и закончить анализ через 18 - 24 ч.
Если
красные и темно-красные колонии с
металлическим блеском и без него
(лактозоположительные) образованы
грамотрицательными палочками, не
обладающими оксидазной активностью,
то их число подсчитывают
на всех фильтрах и выражают результат
анализа КОЕ в 100 мл воды. Вычисления
проводят по формуле:
,
где: х – число колоний в 100 мл;
v – объем воды, профильтрованной через фильтры, на которых велся учет;
а – число подсчитанных на этих фильтрах колоний в сумме.
В сомнительных случаях, когда нет уверенности, что колонии образованы бактериями, ферментирующими лактозу, а также при наличии на фильтрах розовых, розовых с центром, бесцветных колоний грамотрицательных и оксидазоотрицательных палочек, их подсчитывают (каждый тип колоний отдельно) и принадлежность к БГКП подтверждают посевом двух-трех изолированных колоний каждого типа в полужидкую среду с глюкозой. Учет производят через 4 - 5 ч инкубации посевов при 37 °С. При образовании кислоты и газа результат считают положительным, при отсутствии кислоты и газа - отрицательным. Анализ заканчивают через 24 - 28 ч. При наличии только кислоты пробирки оставляют в термостате для окончательного учета газа через 24 ч.
Подсчитывают сумму лактозоположительных колоний и тех из лактозоотрицательных, которые ферментируют глюкозу с образованием кислоты и газа при 37 °С в течение 24 ч.
Титрационный метод определения бактерий группы кишечных палочек с использованием среды КОДА
Среда имеет в своем составе ингибитор, не требует строгой асептики и не теряет свойств под воздействием света. Ориентировочный ответ может быть дан по изменению цвета индикатора. Для посева 1 мл воды и ее разведений используют среду нормальной концентрации. Для посева 10, 50 и 100 мл воды используют соответствующие объемы среды двойной концентрации, увеличивая количество сухого препарата на тот же объем воды в 2 раза.
При исследовании питьевой воды централизованного водоснабжения засевают 3 объема по 100 мл, 3 объема по 10 мл и 3 объема по 1 мл. При исследовании питьевой воды децентрализованного водоснабжения засевают 1 объем по 50 мл, 5 объемов по 10 мл и 5 объемов по 1 мл. 100 и 10 мл воды вносят во флаконы и пробирки с 100 и 10мл концентрированной среды КОДА. 1 мл воды и 1 мл из разбавлений вносят в пробирки с 10 мл среды нормальной концентрации. Посевы инкубируют при 37 °С.
Результаты учитывают предварительно через 24 ч, окончательно - через 48 ч. Положительным считается появление мути и изменение цвета индикатора. Коли-индекс высчитывают по таблице 5.
Таблица 5
Таблица расчета наиболее вероятного числа микроорганизмов (расчет наиболее вероятного числа бактерий в