Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Основы микроб ГУсЭ.doc
Скачиваний:
0
Добавлен:
11.11.2019
Размер:
916.99 Кб
Скачать

Особенности культивирования облигатно-анаэробных бактерий

Облигатными анаэробами называют микроорганизмы, обладающие фер-ментативным метаболизмом и не растущие на поверхности аэрируемой пита-тельной среды.

В зависимости от отношения к свободному кислороду облигатные анаэробы делят на умеренные и строгие. Большинство значимых анаэробов (клостридии, бактероиды, фузобактерии, пептококки и др.) относятся к категории умеренных. Они толерантны к кислороду в течение нескольких десятков минут и не растут при его концентрации в среде более 3 %. Строгие анаэробы (метанобактерии и др.) чрезвычайно чувствительны к токси-ческому действию кислорода и не рас-тут при его содержании в среде более 0,5 %.

Биологические особенности облигатных анаэробов обусловливают необхо-димость применения специальных методов культивирования, отличающихся от используемых при работе с аэробными и факультативно-анаэробными микро-организмами.

Важным условием, которое необходимо соблюдать на всех этапах выделения и идентификации анаэробов, является защита этих микроорганизмов от ток-сического действия молекулярного кислорода. Время между взятием материала и его посевом на питательные среды должно быть максимально коротким. Для защиты содержащихся в патологическом материале облигатных анаэробов от воздействия атмосферного кислорода используют специальные транспортные среды.

Анаэробные бактерии можно культивировать только на специальных бес-кислородных питательных средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом (-10 - 150 мв). Для контроля за степенью насыщения этих сред кислородом используют специальные редокс-индикаторы (метиленовый синий, резазурин), восстановленные формы которых бесцветны. При возрастании окислительно-восстановительного потенциала (ОВП) метиленовый синий окра-шивает среды в синий, а резазурин − в розовый цвет, что указывает на непри-годность таких питательных сред для культивирования облигатных анаэробов.

Для сохранения низкого ОВП питательные среды должны быть агаризованы. Добавление даже 0,05 % агара повышает их вязкость и уменьшает ее аэрацию. Для получения роста облигатно-анаэробных бактерий плотные питательные среды должны быть свежеприготовленными (не более 2 ч. после приготовле-ния) или прередуцированными (выдержаны в анаэростате не менее суток). Для успешного выращивания анаэробов требуется внесение большого количества посевного материала. Это связано с тем, что большие концентрации облигатных анаэробов способны быстрее уменьшать ОВП среды и тем самым создавать бла-гоприятные условия для своего роста.

Анаэробный тип дыхания во много раз менее продуктивный, чем аэробный, поэтому питательные среды для анаэробов должны быть значительно богаче пи-тательными субстратами и витаминами. В качестве питательной основы они со-держат различные экстракты и белковые гидролизаты (сердечно-мозговой и пе-ченочный настои, дрожжевой и соевый экстракты, пептон, триптон, гидролити-ческий перевар казеина и др.), факторы роста (гемин, менадион, твин-80, сук-цинат натрия и др.), цельную или лизированную кровь. Для выделения различ-ных анаэробов из смеси культур к питательным основам добавляют желчь, азид натрия, антибиотики, налидиксовую кислоту, малахитовый зеленый и другие ингредиенты. В практических лабораториях для выделения анаэробов из пато-логического материала чаще всего используют среду для контроля стериль-ности (СКС), среду Китта − Тароцции, анаэробный кровяной агар (на основе эритрит-агара или агара Д), среду Вильсона − Блера и некоторые другие с соот-ветствующими добавками.

Методы создания анаэробных условий

Необходимым условием культивирования анаэробных бактерий является соз-дание анаэробных условий, что достигается с помощью физических, химичес-ких, биологических и смешанных методов.

Физические методы

1. Для того, чтобы удалить растворенный в питательных средах кислород, производят их регенерацию путем кипячения в течение 15-20 мин. на водяной бане с последующим быстрым охлаждением до 45-50 оС.

После посева для предотвращения проникновения кислорода в жидкую пи-тательную среду ее поверхность заливают стерильным вазелиновым маслом или парафином.

2. Посев содержащего анаэробы патологического материала в высокий стол-бик плотной или полужидкой питательной среды, которая разливается в про-бирки в объеме 10-12 мл. Кислород воздуха диффундирует обычно на рассто-яние 1,5-2,0 см от поверхности, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.

3. Эвакуационно-заместительный метод заключается в удалении воздуха из герметически закрытых сосудов (анаэростатов, анаэробных боксов) с помощью вакуумного насоса с последующей заменой его инертным газом (аргон, гелий) или бескислородной газовой смесью, состоящей из 80 % азота, 10 % оксида уг-лерода IVи 10 % водорода. В ряде случаев используют природный (магистраль-ный) газ. Для поглощения остатков кислорода из газовой смеси используют пал-ладиевый катализатор. Для поглощения водяных паров на дно анаэростата (рис.12) помещают 5-6 г безводного хлорида кальция, 10-12 г силикагеля.

Рисунок 12. Анаэростат

Химические методы

1. Применение щелочных растворов пирогаллола для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде. Для поглощения кислорода из 220 мл воздуха применяют смесь, состоящую из 1 мл 20% раствора пирогаллола и 1 мл насы-щенного раствора карбоната натрия Nа2CO3.

2. Для поглощения кислорода из замкнутого пространства можно применять гидросульфит натрия. Для связывания кислорода в 1 л объема берут 100 мл свежеприготовленного 20% раствора Na2S2O4 и 16 мл 50% KOH. Эти реагенты связывают кислород быстрее, чем пирогаллол.

3. Для связывания остатков кислорода в предназначенных для роста ана-эробов питательных средах используют вещества-редуценты, к которым от-носятся тиогликолевая кислота или тиогликолят натрия (0,01-0,02%), аскор-биновая кислота (0,1%), различные сахара (0,1-3%), цистин и цистеин (0,03-0,05%), формиат натрия (0,25-0,75%) и др.

4. Применение газогенерирующих систем для создания анаэробных условий в замкнутой воздушной среде (микроанаэростатах, эксикаторах, прозрачных газо-непроницаемых пластиковых пакетах).

С целью образования водорода и оксида углерода (IV), необходимых для рос-та облигатных анаэробов, используют специальные таблетки, которые активи-руются добавлением воды. Водород, генерируемый таблетками боргидрида нат-рия, связывает кислород воздуха в присутствии палладиевого катализатора с об-разованием воды. Углекислый газ вырабатывается при взаимо-действии лимон-ной кислоты с гидрокарбонатом натрия.

Биологические методы

1. Совместное выращивание анаэробов и аэробов (метод Фортнера). При этом на одну половину чашки Петри с плотной питательной средой засевают иссле-дуемый материал, а на другую − культуру аэробного или факультативно-анаэ-робного микроорганизма, способного энергично поглощать кислород. После посева чашку закрывают крышкой, края которой для герметизации заливают парафином или заклеивают пластилином. В качестве активного поглотителя кислорода из замкнутого пространства часто используют культуру «чудесной палочки» (Serratia marcescens), которая является своеобразным индикатором качества анаэробиоза. При недостаточной герметизации чашки этот микроор-ганизм образует ярко-красный пигмент, а при сохранении строго анаэробных условий вырастают бесцветные или бледно-розовые колонии.

2. Помещение в питательную среду кусочков печени, головного мозга, почек и других внутренних органов. При этом тканевые клетки активно поглощают и адсорбируют на себе кислород, в результате чего в среде создаются анаэробные условия. Примером питательной среды, сконструированной по этому принципу, является содержащая кусочки печени среда Китта − Тароцци. К тому же в пе-ченочной ткани содержится большое количество веществ с SH-группой (цис-теин, глютатион и др.), обладающих сильным редуцирующим действием.

3. Культуры некоторых облигатных анаэробов можно поддерживать путем пассажа на лабораторных животных, однако в настоящее время этот метод используется достаточно редко.

В большинстве практических лабораторий используют смешанные методы создания анаэробных условий. Для работы с наиболее чувствительными к мо-лекулярному кислороду анаэробами используют строгую анаэробную технику. Принцип метода заключается в использовании лишенных кислорода пита-тельных сред, воздух над которыми удаляется и замещается бескислородным газом.

Для предотвращения попадания кислорода сосуды с питательными средами закрываются резиновыми пробками. Во время инокуляции анаэробиоз поддер-живается за счет постоянного омывания сред потоком бескислородного газа.

Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов

Метод Цейсслера

Исследуемый материал рассевают штрихами по поверхности плотной пита-тельной среды, помещают в анаэробные условия и выдерживают в термостате при 37 оС в течение 24-72 ч. Изолированные колонии анаэробов пересевают в среду для контроля стерильности (СКС) или среду Китта − Тароцции.

Метод Вейнберга

Несколько капель исследуемого материала вносят в пробирку с 4-5 мл изо-тонического раствора хлористого натрия, перемешивают запаянным капил-ляром и переносят в пробирку с охлажденным до 45-50 оС сахарным агаром, разлитым высоким столбиком. После перемешивания этим же капилляром последовательно засевают еще две пробирки с сахарным агаром и быстро ох-лаждают под струей холодной воды. Выросшие через 24-72 ч. в глубине агара изолированные колонии анаэробов засевают в среду Китта −  Тароцци или СКС.

Метод Вейона − Виньяля

Готовят разведения исследуемого материала в пробирках с сахарным агаром, как указано выше. Из каждой пробирки разведенный материал насасывают в пастеровские пипетки, после чего запаивают их концы. После получения микро-бного роста пипетку надпиливают в соответствующем месте, разламывают с соблюдением правил стерильности и переносят изолированную колонию в среду Китта − Тароцции или СКС.

Метод Перетца

Готовят разведения исследуемого материала как указано выше. Содержимое пробирки с соответствующим разведением выливают в стерильную чашку Пет-ри, на дне которой на двух стеклянных или деревянных палочках лежит стек-лянная пластинка размером 6х6 см. Среду заливают сбоку таким образом, чтобы она полностью заполнила пространство между пластинкой и дном чашки Петри. При появлении микробного роста стеклянную пластинку удаляют, а изолиро-ванную колонию засевают в пробирку со средой Китта − Тароцции или СКС для получения чистой культуры.

Наиболее простой и удобной разновидностью метода Перетца является метод «перевернутых чашек». При этом каждое разведение исследуемого материала в пробирке с сахарным агаром заливают в крышку чашки Петри и закрывают ее стерильным донышком чашки, избегая образования пузырей воздуха. Щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают расплавленным парафи-ном. Термостатируют при 37 оС до появления изолированных колоний анаэ-ро-бов.

Питательные среды для выделения и идентификации анаэробов

Анаэробный кровяной агар

Готовится на основе эритрит-агара. В качестве добавок используют среду 199 (10%), гемин (10 мкг/мл), твин-80 (0,1%), менадион (10 мкг/мл), цитратную кровь (5%) и некоторые другие. После приготовления и стерилизации разлива-ют в чашки Петри. Для посева используют свежеразлитые (не позднее чем 1,5-2 ч. после приготовления) или прередуцированные (не менее суток выдержанные в анаэробных условиях) среды.

Анаэробный кровяной агар с селективными добавками

Для подавления роста факультативно-анаэробных бактерий в питательную среду добавляют один из следующих антимикробных препаратов: неомицин или канамицин (75-80 мкг/мл), гентамицин (50 мкг/мл), налидиксовую кислоту (40 мкг/мл). Вместо этих добавок на поверхность засеянной питательной среды можно накладывать по 2-4 диска с канамицином (по 1000 мкг в диске).

Желточный агар

В питательную среду на основе эритрит-агара добавляют гемин (10 мкг/мл), глюкозу(0,2%), суспензию яичного желтка (20%) и некоторые другие ингреди-енты. Разливают в чашки Петри, используют для обнаружения лецитовителлаз-ной и липазной активности анаэробных бактерий. При наличии фермента ле-цитиназы (продуцировании альфа-токсина C.perfringens) вокруг выросших на чашке колоний микроорганизмов образуются зоны помутнения (преципитата), а при наличии липазы − зоны радужной блестящей опалесценции, видимой при косом освещении.

Среда для контроля стерильности (СКС)

Это коммерческая питательная среда. Используется как транспортная и как среда накопления. Может применяться с селективными добавками (см. выше). Разливается в пробирки «высоким столбиком». Для обогащения питательной среды дополнительными факторами роста используют среду 199 (10%), гемин (10 мкг/мл), твин-80 (0,1%), менадион (10 мкг/мл) и некоторые другие.

Среда Китта − Тароцции

Готовится на основе бульона Хоттингера с добавлением кусочков печени или мяса и разливается по пробиркам. Используется в качестве среды накопления. После посева патологического материала поверхность питательной среды зали-вают небольшим слоем вазелинового масла или расплавленного парафина.

Среда Вильсона − Блера

Готовится на основе сахарного агара с добавлением сернистокислого натрия (1%) и хлорного железа (0,08%), разливается по пробиркам «высоким столби-ком». Используется для ускоренной диагностики газовой гангрены. При нали-чии в исследуемом материале C.perfringens через 4-6 ч. инкубации при темпе-ратуре 42 оС среда чернеет, и в ней появляются множественные разрывы агара.

Среды для определения редуцирующей способности. В эту группу входят среды с красками, обесцвечивающимися при восстановлении (например, метиленовый голубой, нейтральный красный, индигокармйн), а также среды с нитратами для определения денитрифицирующей активности бактерий (при положительном результате среды окрашиваются в синий цвет). Примером такой среды является лакмусовое молоко.

Лакмусовое молоко

Готовится на основе свежего снятого молока с добавлением лакмусовой нас-тойки, разливается в пробирки «высоким столбиком». Используется для уско-ренной анаэробных палочек (например, клостридий). При наличии в исследуемом материале C.perfringens через 2-4 ч. инкубации при температуре 42 оС в среде появляется кирпично-красный, пронизанный пузырьками газа творожистый осадок казеина и прозрачная сыворотка.

Сахарный агар

Готовится на основе эритрит-агара с добавлением 1% глюкозы. Разливают в пробирки по 10-15 мл. Используется для выделения анаэробов по методам Вейнберга, Вейона − Виньяля, Перетца.

Среды для определения сахаролитических свойств анаэробов

Содержат 0,5 % мясо-пептонного агара, 1 % испытуемых углеводов и инди-катор рН. Разливаются в пробирки «высоким столбиком», не требуют добавле-ния вазелинового масла.

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.