Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Основы микроб ГУсЭ.doc
Скачиваний:
34
Добавлен:
11.11.2019
Размер:
916.99 Кб
Скачать

Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий

Исследуемый материал

I этап (нативный материал)

Микроскопия (ориентировочное представление о микрофлоре).

Подготовка материала к исследованию.

Посев на среды обогащения.

Посев на плотные питательные среды (получение колоний).

II этап (изолированные колонии)

Макроскопическое изучение колоний в проходящем и отраженном свете (величина, форма, цвет, прозрачность, положение, поверхность, консистенция, структура, края).

Микроскопическое изучение колоний под малым увеличением микроскопа и в окрашенном мазке.

Постановка пробы на аэротолерантность.

Посев на скошенный питательный агар (выделение чистой культуры).

III этап (чистая культура)

Идентификация выделенной культуры по комплексу биологических свойств:

морфология и тинкториальные свойства, культуральные свойства, биохимические свойства, чувствительность к антибиотикам, другие свойства.

Заключение о выделенной культуре.

Посев шпателем

Производят в следующей последовательности:

а) на поверхность питательной среды в чашке № 1 наносят стерильной пипеткой каплю накопительной культуры и распределяют ее стерильным шпателем;

б) шпатель достают, чашку быстро закрывают и переносят шпатель в чашку № 2, не стерилизуя его. Имитируют распределение культуры по всей поверхности среды, прикасаясь к ее поверхности той же стороной шпателя, которой ранее распределяли пробу;

в) точно те же действия проводят и в чашке № 3, после чего шпатель стерилизуют;

г) после посева металлический шпатель прокаливают в пламени горелки, а стеклянный помещают в дезинфицирующий раствор.

д) засеянные чашки помещают в термостат и инкубируют при оптимальной температуре.

Через определенное время чашки достают из термостата и изучают рост микроорганизмов. Обычно в чашке № 1 наблюдается сплошной рост бактерий, в последующих чашках формируются изолированные колонии.

Посев тампоном

Тампон с исследуемым материалом вносят в чашку и круговыми движениями втирают его содержимое в поверхность среды, одновременно вращая тампон и чашку.

Посев на секторы

Дно чашки расчерчивают на секторы, посев производят зигзагообразными движениями от края чашки к центру так, чтобы штрихи с одного сектора не пе-реходили на другой.

Посев газоном

1 мл исследуемого материала (жидкая бульонная культура или взвесь микро-организмов в физиологическом растворе) наносят пипеткой на поверхность среды и тщательно распределяют жидкость по всей ее поверхности. Избыток материала отсасывают пипеткой и вместе с ней помещают в дезинфицирующий раствор.

После посева чашки закрывают и переворачивают их вверх дном. Надписи на чашках делают со стороны дна, а на пробирках − в верхней части.

При посеве инокулята из пробирки в пробирку обе пробирки (с посевным материалом и со средой) держат слегка наклонно в левой руке между большим и указательным пальцами так, чтобы края пробирок были на одном уровне. Бактериальную петлю держат как авторучку. Петлю вертикально прокаливают в пламени горелки. Пробки из пробирок вынимают правой рукой, зажимая их между мизинцем и ладонью. Вынув пробки, края пробирок обжигают в пламени горелок. Прокаленную петлю вводят через пламя горелки в пробирку с по-севным материалом, охлаждают и, набрав небольшое количество посевного материала, осторожно переносят его в пробирку со средой.

При посеве на жидкую среду петлю слегка погружают в жидкость и расти-рают посевной материал на стенке пробирки, после чего смывают его средой.

Для посева жидкого материала можно использовать стерильные пипетки (пастеровские или градуированные).

При посеве на скошенный агар материал наносят штрихообразными дви-жениями снизу вверх, начиная с конденсационной воды, а если агар или же-латин разлит в пробирки столбиком, то посев производят уколом, прокалывая петлей с посевным материалом столбик до дна.

После посева петлю извлекают из пробирки, пробирку закрывают, предва-рительно проведя ее края через пламя горелки. Петлю прокаливают.

При выделении чистых культур аэробов можно использовать не только ме-тоды, основанные на механическом разобщении бактерий, но и методы, осно-ванные на различиях бактерий по биологическим свойствам. Так, например, некоторые подвижные бактерии могут быстро распространяться по слегка влажной поверхности питательной среды, благодаря этому можно очистить их от неподвижных видов микробов.

Иногда при выделении микроорганизмов из природных популяций полезно включить в среду вещества, избирательно подавляющие рост тех или иных микробов. Например, добавление полиеновых антибиотиков (нистатина) в среду используется для очистки бактериальных культур, сильно загрязненных гри-бами.

Посевы инкубируются в термостате 18-24 ч. В течение этого времени из отдельных микробных клеток формируются изолированные колонии.

Колония — это популяция микробных клеток одного вида, сформировав-шаяся в результате деления одной микробной клетки в условиях культивиро-вания на плотной питательной среде при оптимальной температуре.

Изучение изолированных колоний и отвивка чистых культур

Изучение изолированных колоний составляет второй этап исследования. Строение колоний является важным культуральным признаком при определе-нии вида микроорганизмов, так как каждому виду микробов при росте на опре-деленной плотной питательной среде присуща типичная форма колонии.

Колонии изучают невооруженным глазом в проходящем и отраженном свете и с помощью лупы или под микроскопом при малом увеличении.

При описании колоний учитывают следующие признаки:

  • форму колонии - округлая, амебовидная, ризоидная , неправильная и т.д.;

  • размер (диаметр) колонии - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);

  • поверхность колонии - гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;

  • профиль колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т.д.;

  • прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;

  • цвет колонии (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием;

  • край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.;

  • структура колонии - однородная, мелко или крупнозернистая, струйчатая;

  • консистенция колонии - определяют прикасаясь к поверхности петлей, колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).

Важно определить тип колонии. Различают два основных типа колоний бактериальной культуры:

1) колонии гладкие – S-тип (от англ. Smooth − гладкий), характеризующийся круглой и выпуклой формой, гладкой поверхностью, влажной консистенцией;

2) колонии шероховатые – R-тип (от англ. Rough − шероховатый), характеризующийся шероховатой поверхностью, неправильными краями, сухой консистенцией. Образуются из гладких S-форм в результате мутации.

Помимо этих двух основных типов колоний существует так называемый слизистый М-тип (от лат. Mucus − слизистый), характеризующийся тягучей слизистой консистенцией. Образуется в процессе диссоциации бактериальных культур. Основные типы колоний представлены на рисунке 10.

Рисунок 10. Основные типы колоний

Описание роста микроорганизмов при посеве штрихом включает его особенности: скудный, умеренный, обильный; сплошной с ровным или волнистым краем; диффузный; перистый; ризоидный; древовидный. Характеризуют цвет, поверхность, консистенцию.

Часть изученной колонии берут для приготовления мазка, который окра-шивают и микроскопируют. Если при микроскопии подтверждается однородность состава колонии, то оставшуюся ее часть отвивают на скошенный агар для накопления чистой культуры.

В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка.

  • Рост бактерий с равномерным помутнением среды характерно для факультативных анаэробов. Степень помутнения может быть слабая, умеренная, сильная.

  • Придонный рост бактерий характеризуется образованием осадка: скудного, обильного, рыхлого, слизистого, хлопьевидного, зернистого. Питательная среда может быть прозрачной или мутной.

  • Пристеночный рост - образование зерен, рыхлых хлопьев на внутренней поверхности стенок сосуда. Питательная среда при этом остается прозрачной.

  • Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности среды пленки: тонкой, плотной, рыхлой, гладкой, складчатой, влажной, сухой, кольцеобразной, сплошной. Такой рост наблюдается при культивировании аэробных бактерий.

Изучение биохимических свойств выделенных микроорганизмов

Биохимические свойства выделенных микроорганизмов изучают на третьем этапе. Культуру микроорганизмов, выросшую на скошенном агаре, проверяют на чистоту путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При микроско-пии обращают внимание на форму микроба, величину, расположение клетки. Специальными окрасками выявляют споры, капсулы, включения и жгутики.

Для идентификации культур, то есть установления вида и типа бактерий, помимо морфологических и культуральных признаков изучают биохимические, антигенные и другие свойства.

Определение протеолитических свойств микробов

Действие протеолитических ферментов, то есть способность микроорга-низмов расщеплять белки, изучают на средах с желатином, молоком, сы-вороткой, пептоном. Мясо-пептонную желатину (МПЖ) готовят следующим образом: к 100 мл мясо-пептонного бульона (МПБ) добавляют 10-15 г желатины, оставляют на 20-30 мин, чтобы желатина набухла, затем смесь нагревают на водяной бане до полного растворения желатины и разливают полученную МПЖ в пробирки по 8-10 мл. Стерилизуют при 0,5 атм 15 мин. Посев проводят уколом. Продолжительность культивирования 7-10 суток при комнатной температуре. Разжижение желатины или его отсутствие отмечают визуально. Если желатина разжижается, указывают интенсивность и форму разжижения –послойное, воронковидное, мешковидное, пузыревидное и т.д. (рис. 11).

Рисунок 11. Схема разжижения желатины микроорганизмами при посеве уколом.

Действие микроорганизмов, разлагающих казеин (молочный белок), проявляется в пептонизации (просветлении) молока, которое приобретает вид молочной сыворотки.

В процессе ферментации пептонов микроорганизмами образуются индол (C8Н7N), сероводород (Н2S), аммиак (NH3) и другие соединения.

Для обнаружения сероводорода в пробирку с МПБ после посева исследуемой культуры под пробку помещают узкую полоску фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца: уксуснокислого свинца Рb(CH3COO)− 30 г; гидрокарбоната натрия NaHCO− 1г; дистиллированной воды − 100 мл. При наличии сероводорода индикаторная бумага чернеет вследствие образования сульфида свинца (II) PbS.

Для выявления индола используют индикаторную бумажку, пропитанную горячим насыщенным раствором щавелевой кислоты C2H2O4. В присутствии индола бумага становится красной. Определение индола можно провести и с помощью реактива Эрлиха, который состоит из р--диметиламидо-бензаль-дегида − 5 г, очищенной концентрированной фосфорной кислоты Н3 10 мл и 96% этилового спирта −50 мл. К 48-часовой бульонной культуре прибавляют 1-2 мл серного эфира, основательно встряхивают и затем прибавляют по стенке пробирки 4-5 капель реактива Эрлиха. Через 1-2 мин. . появляется ярко-ма-линовое кольцо в нижней части эфирного слоя, которое свидетельствует о на-личии индола.

Аммиак определяют при помощи увлажненной красной лакмусовой бумажки. В присутствии аммиака бумажка синеет.

Определение сахаролитических свойств микробов

Способность микроорганизмов разлагать сахара и многоатомные спирты с образованием кислоты, а иногда и газа изучают на средах Гисса. В состав этих сред входят пептонная вода, углевод (моносахариды − глюкоза, ксилоза, араби-ноза; полисахариды − крахмал, гликоген), многоатомные спирты (глицерин, маннит, сорбит, инозит) и индикатор. Под действием образующейся при разло-жении углевода кислоты индикатор изменяет окраску среды. Газообразование определяется по наличию пузырьков газа в толщине полужидких сред или, если среда жидкая, в поплавке (стеклянная трубочка, верхний конец которой запаян).

Сахаролитические свойства изучают и на средах Эндо, Левина, Плоскирева. В состав этих сред входит молочный сахар − лактоза, и если микроорганизмы разлагают его до кислоты, то цвет колонии изменяется соответственно инди-катору, находящемуся в среде.

Определение ферментов микробов

Биохимическая активность микроорганизмов обусловлена их ферментатив-ной деятельностью. Ферменты микроорганизмов являются биологическими катализаторами, определяющими метаболические процессы, протекающие в микробных клетках. Разные виды микроорганизмов нередко отличаются по набору ферментов, которые они способны синтезировать.

Каталаза − это фермент, катализирующий разложение перекиси водорода с образованием воды и кислорода. Каталаза содержится у аэробов факультатив-ных анаэробов, но не содержится у облигатных анаэробов. Обнаружить ката-лазу можно по пузырькам кислорода, которые начинают выделяться сразу же после смешивания микробных клеток с 1% раствором перекиси. На предметное стекло помещают каплю перекиси водорода и суспензируют в ней небольшое количество микробной культуры, выращенной на плотной среде.

Определение оксидазы- проводят несколькими методами, например: на поверхность фильтровальной бумаги наносят несколько капель 1% водного раствора диметилпарафенилендиамина, снимают запаянным изогнутыи концом Пастеровской пипеткой часть суточной агаровой культуры и растирают ее по поверхности фильтровальной бумаги, обработанной реактивом. Фильтровальная бумага через 1мин окрасится в красный цвет-культура обладает оксидазной активностью (оксидазоположительная); для оксидазоотрицательные культур характерно синее окрашивание фильтровальной бумаги.

Реактив Ковача:

Диффузный метод определения ферментов − экспресс-метод может быть использован для поиска активных продуцентов ферментов в природных популяциях микроорганизмов.

Принцип метода. Горячий 3%-ый раствор агара-агара смешивают с равным объёмом раствора субстрата, перемешивают и разливают в чашки Петри. После застывания агара в нем делают лунки, в которые вносят раствор фермента, например, культуральную жидкость, испытуемого микроорганизма. Чашки выдерживают 18 часов при 37 0С, затем выявляют и измеряют зоны превращения субстрата.

Обнаружение амилазы

Субстрат: 1,6 % раствор крахмала кипятят 3 минуты при перемешивании. Полученный раствор смешивают равным объёмом ацетатного буфера рН 5,0, содержащего NaCl (0,4 М буфер и 0,4 М раствор NaCl в равных объёмах).

Окрашивание раствором Люголя 1 мин.

Обнаружение липаз

Субстраты: 0,2 М фосфатный буфер рН 7,6 смешивают с равным объёмом горячего агар-агара, добавляют 0,1% подсолнечного масла, перемешивают 1 минуту в гомогенизаторе и разливают в чашки. Об активности ферментов судят по образованию зоны просветления вокруг лунки.