- •Предисловие
- •Тема № 1. Правила работы и устройство микробиологической лаборатории. Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски
- •Организация микробиологической лаборатории
- •Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски
- •Исследование микроорганизмов в окрашенном состоянии
- •Окраска по Граму
- •Окраска кислотоустойчивых бактерий
- •Окраска спор
- •Окраска включений волютина
- •Обнаружение капсул у бактерий
- •Окраска по Романовскому – Гимзе
- •Тема № 2. Морфология бактерий. Ультраструктура бактериальной клетки
- •Морфология бактерий
- •Структура бактериальной клетки
- •Тема № 3. Физиология, биохимия бактерий. Питательные среды. Этапы выделения и идентификации чистых культур аэробных и анаэробных бактерий
- •Культивирование микроорганизмов в лабораторных условиях
- •Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий
- •Особенности культивирования облигатно-анаэробных бактерий
- •Краткая характеристика питательных сред
- •Тема № 4. Асептика, антисептика, стерилизация
- •Стерилизация
- •Соотношение показаний манометра и температуры
- •Дезинфекция
- •Асептика
- •Антисептика
- •Классификация дезинфицирующих и антисептических средств
- •Тема № 5. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы
- •Изучение действия уф-света на микроорганизмы
- •Диско-диффузионный метод
- •Фитонциды
- •Тема № 6. Количественное определение микроорганизмов
- •Количественное определение микроорганизмов методом непосредственного (прямого) подсчёта
- •Определение количества дрожжевых клеток в 1 г прессованных хлебопекарных дрожжей с помощью камеры Горяева
- •Определение количества микробных клеток фотометрическим методом
- •Определение числа клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха).
- •Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений).
- •Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объёма исходной суспензии (по Мак-Креди)
- •Тема № 7. Возбудители бактериальных кишечных инфекций
- •Эшерихии
- •Сальмонеллы
- •Тема № 8. Основы санитарной микробиологии
- •Основные понятия и термины санитарной микробиологии
- •Общая характеристика санитарно-показательных микроорганизмов
- •Первая группа санитарно- показательных микроорганизмов
- •Вторая группа санитарно- показательных микроорганизмов
- •Санитарно-микробиологическое исследование почвы
- •Санитарно-микробиологическое исследование воды
- •100 Мл питьевой воды)
- •Санитарно-микробиологическое исследование воздуха
- •Тема № 9. Санитарная микробиология пищевых продуктов. Пищевые токсикоинфекции и интоксикации
- •Санитарная микробиология мясных продуктов
- •Бактериологическое исследование консервов
- •Санитарно-микробиологическое исследование молока и молочных продуктов
- •Санитарно-микробиологическое исследование смывов с объектов внешней среды
- •Пищевые токсикоинфекции и интоксикации
- •Тестовые задания
- •Литература.
- •Оглавление
Морфология бактерий
По форме клеток бактерии делятся на шаровидные, палочковидные и извитые. Шаровидные бактерии (кокки) имеют сферическую форму и по взаимному расположению клеток после деления различаются:
микрококки- клетки расходятся и располагаются одиночно;
диплококки- клетки располагаются попарно;
стрептококки-кокки делятся в одной плоскости и не расходятся после деления;
тетракокки-деление клеток происходит в двух взаимно перпендикулярных плоскостях и клетки располагаются по четыре;
сарцины (пакеты)- деление происходит в трёх взаимно перпендикулярных плоскостях;
скопления кокков, внешне напоминающие виноградную гроздь, называются стафилококками.
Кокки имеют диаметр 1-2 мкм.
Палочковидные бактерии различаются формой клеток, размерами и расположением. Длина их в зависимости от вида микроорганизма колеблется от 0,5 до 8 мкм, а поперечник – от 0,3 до 2 мкм.
Палочки могут быть правильной и неправильной формы, в том числе ветвящиеся, например у актиномицетов. По характеру расположения клеток в мазках выделяют:
монобактерии – расположены отдельными клетками;
диплобактерии – расположены по две клетки;
стрептобактериии – после деления образуют цепочки клеток. Палочковидные бактерии могут образовывать споры: бациллы и клостридии.
Извитые формы бактерий представлены изогнутыми палочками и могут иметь один или несколько витков спирали. Слегка изогнутые палочки называются вибрионами. Они имеют длину 1-3 мкм.
Спириллы- длинные, изогнутые (один или несколько завитков).
Спирохеты – длинные, тонкие клетки с большим количеством мелких завитков.
Структура бактериальной клетки
Клетка — универсальная структурная единица живой материи. Организация бактериальной клетки обеспечивает удвоение биомассы за определенный срок за счет размножения посредством бинарного деления.
Элементы ультраструктуры бактериальной клетки
В составе прокариотической клетки выделяют следующие структуры.
1. Клеточная стенка; по химической структуре клеточной стенки различают грамположительные и грамотрицательные бактерии.
2. Периплазматическое пространство.
3. Цитоплазматическая мембрана.
4. Цитоплазма, нуклеоид, мезосомы (аналог митохондрий у эукариотов), рибосомы, включения;
5. У некоторых бактерий – капсула, микрокапсула, жгутики, плазмиды, фимбрии (реснички), споры.
Клеточная стенка — важный и обязательный структурный элемент подавляющего большинства прокариотных клеток. На долю клеточной стенки приходится от 5 до 50% сухих веществ клетки. Клеточная стенка служит механическим барьером между протопластом и внешней средой и придает клеткам определенную, присущую им форму.
Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет однородную струк-туру, ковалентно связана с ригидным слоем, содержит небольшие количества липидов, полисахаридов и белков. Она значительно толще, чем у грамотри-цательных бактерий, и достигает 20-60 нм. Основную массу стенки составляют 5-6 слов пептидогликана, с которым ковалентно связаны тейхоевые кислоты. Особенностью пептидогликанов грамположительных бактерий является от-сутствие диаминопимелиновой кислоты.
Толщина клеточной стенки грамотрицательных бактерий составляет 14-18 нм. Ригидный слой представлен 1-2 слоями пептидогликана, в котором есть диаминопимелиновая кислота. В составе клеточной стенки содержится много лиопротеинов, фосфолипидов, липополисахаридов, больше белка, но отсутст-вуют тейхоевые кислоты. Пластичный слой клеточной стенки представлен сложной мозаикой из липопротеинов, липополисахаридов и наружной мембра-ны.
Некоторые бактерии имеют пространство (зону) между клеточной стенкой и плазматической мембраной - периплазматическое пространство (периплазма). Толщина периплазмы составляет около 10 нм и может включать до 20% всей находящейся в клетке воды. В ней локализуются некоторые ферменты и транспортные белки - переносчики соответствующих субстратов.
К клеточной оболочке бактериальной клетки тесно прилегает внешний слой цитоплазмы - цитоплазматическая мембрана. Она состоит из двух слоев липидов и встроенных в липидную мембрану белковых молекул. Компоненты цитоплазматической мембраны ( ЦПМ ) составляют около 10% сухого веса бактериальной клетки. Эта полупроницаемая мембрана контролирует транспорт питательных веществ и воды в клетку, а также является физическим барьером между внутренним содержимым бактериальной клетки и внешней средой.
Содержимое тела бактериальной клетки, или ее цитоплазма, представляет собой желеобразный, вязкий раствор, в котором растворены различные органические и неорганические соединения. Бактериальная цитоплазма неподвижна, имеет высокую плотность, содержит мелкие зерна, состоящие из 60% РНК и 40% протеина, представляющие собой рибонуклеопротеиды, получившие название «рибосом». Они выполняют функцию синтеза белка. Цитоплазма большинства бактерий содержит ДНК и запасные гранулы (крахмала, гликогена, жировых веществ), пигментные скопления, сера, кальций.
Нуклеоид, ядерное вещество клетки, ее наследственный аппарат, состоит из двойной нити ДНК, сомкнутой в кольцо и свободно погруженное в цитоплазму, в отличие от эукариот. В молекуле ДНК закодирована генетическая информация клетки.
Мембранные структуры прокариот менее дифференцированы, чем органоиды эукариот. Бактерии имеют лишь аналоги некоторые из них. Например, аналогом митохондрий у прокариот являются мезосомы, которые образуются путём инвагинации цитоплазматической мембраны и содержат ферменты, необходимые для синтеза АТФ.
У бактерий различают микрокапсулу, капсулу и слизистый слой, которые относятся к факторам патогенности. Микрокапсулы выявляются на электрон-ных микрофотографиях в виде коротких мукополисахаридных фибрилл. Капсула (слизистый слой) играет роль внешнего покрова бактерии, защищает от неблагоприятного воздействия факторов внешней среды и обнаруживается под световым микроскопом после окрашивания по методу Бурри − Гинса.
У некоторых видов микробов имеются пили (реснички, фимбрии, филаменты), представляющие собой образования, которые значительно короче и тоньше жгутиков. Они покрывают тело клетки. Полагают, что они не являются органами передвижения, а способствуют прикреплению микробных клеток к поверхности некоторых субстратов.
Жгутики предназначены для передвижения бактерий. Жгутики построены из специального белка –флагелина. Длина его составляет 20 мкм, диаметр 10-20 нм.
По расположению жгутиков подвижные микробы подразделяются на 4 группы (рис. 7):
монотрихи — бактерии с одним жгутиком на конце (холерный вибрион);
амфитрихи — бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах;
лофотрихи — бактерии, которые имеют по пучку жгутиков на одном конце (палочки сине-зеленого молока);
перитрихи — бактерии, обладающие жгутиками по всей поверхности тела (кишечная палочка).
Рисунок 7. Жгутикование бактерий:
A — монотрихиальное, B — лофотрихиальное, C — амфитрихиальное, D — перитрихиальное.
Исследование микроорганизмов в живом состоянии
В живом состоянии микроорганизмы исследуют с целью выявления их фор-мы, подвижности или определения прижизненной внутренней структуры. Изучают нативные и окрашенные препараты, используя методы «раздавленной» или «висячей» капли.
Прижизненная (витальная) окраска
Взвесь микроорганизмов вносят в каплю 0,001% раствора метиленового си-него или нейтрального красного. Затем готовят препарат «раздавленная» или «висячая» капля и микроскопируют.
Приготовление препарата «раздавленная капля»
На центр обезжиренного предметного стекла наносят каплю жидкой буль-онной культуры. Если культура выращивалась на плотной питательной среде, то на стекло наносят каплю стерильного изотонического раствора натрия хло-рида, затем петлей прикасаются к культуре и приставшие к ней бактерии раз-мешивают в приготовленной капле. Можно заранее приготовить взвесь микро-организмов в изотоническом растворе и взять каплю из нее. На исследуемый материал накладывают покровное стекло так, чтобы не было пузырьков воз-духа. Каплю надо брать такой величины, чтобы она заполняла все простран-ство между покровным и предметным стеклами и не выступала за края по-кровного. Препарат можно рассматривать как с сухими системами, так и с иммерсионной. Микроскопируют, используя объективы 40х или 90х. Очень хорошие результаты получают, применяя темнопольное или фазово-контраст-ное устройства. Препараты быстро высыхают, поэтому, если их приходится рассматривать не тотчас, а спустя некоторое время, их помещают во влажную камеру (чашку Петри), на дно которой положено 2-3 влажных кружка фильтро-вальной бумаги, покрытых двумя сухими.
Во избежание высыхания препарата и вызываемого конвекцией турбулент-ного движения жидкости подобные препараты можно герметизировать. Для этой цели следует пользоваться парафиновым маслом, смесью равных частей парафина и вазелина или лаком для ногтей.
В центре влажного препарата быстро возникает недостаточность кислорода. В сущности именно это помогло Пастеру открыть анаэробный обмен: наблюдая за препаратом, он заметил, что облигатные анаэробы сохраняли подвижность только в центре, но не по краям.
Подвижные микроорганизмы иногда могут адсорбироваться на стекле; в та-ких случаях подвижность легче наблюдать в «висячей» капле.
Приготовление препарата «висячая капля»
Препарат готовят на покровном стекле, в центр которого наносят одну каплю бактериальной взвеси. Затем предметное стекло с лункой, края которой пред-варительно смазывают вазелином, прижимают к покровному стеклу так, чтобы капля находилась в центре лунки, в результате чего стекла склеиваются. Быстрым движением переворачивают препарат покровным стеклом вверх. Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает. В правильно приготовленном препарате капля свободно висит над лункой, не касаясь ее дна или края (рис.8). Микроскопируют со стороны покровного стекла, при-чем вначале следует найти край на малом увеличении и при суженной диафраг-ме, используя сухой объектив 8х, затем на большом и продолжить наблюдение.
Рисунок 8.Препарат висячая капля
При изучении подвижности микроорганизмов необходимо отличать истин-ную подвижность от броуновского движения, которое является следствием ударов о бактерии движущихся в растворе молекул и выявляется в виде коле-баний. Многие подвижные микроорганизмы движутся очень быстро, что за-трудняет точное наблюдение. Добавляя к суспензии микроорганизмов метил-целлюлозу, можно уменьшить скорость их движения и создать условия, при которых движение жгутиков становится видимым.
Недостатком метода является наличие ряда оптических дефектов, связанных с кривизной лунки, что препятствует получению высококачественных микро-фотографий, а также невозможность использования темнопольного и фазово-контрастного устройств из-за большой толщины предметных стекол с лунками.
КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ
Основные принципы классификации микроорганизмов.
Отличия прокариотических и эукариотических клеток.
Морфология бактерий. Спорообразование у микроорганизмов.
Отличия химического состава и строения клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий.
Структура бактериальной клетки и методы выявления ее элементов.
Морфологические особенности кокков, палочек, спирохет и актиномицетов.
РАБОТА ПОД РУКОВОДСТВОМ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ
Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска простыми методами.
Микроскопия окрашенных препаратов с использованием обычных и иммерсионных систем.
Приготовление фиксированных мазков из бактериальных культур и их окраска сложными методами (по Граму, Цилю − Нильсену, Ожешко, Нейссеру).
Приготовление мазков «висячей» и «раздавленной» капли.
САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ
Приготовить нативные мазки «висячей » и «раздавленной» капли.
Приготовить фиксированные препараты из исследуемой смеси бактериальных культур.
Окрасить фиксированные мазки метиленовым синим.
Окрасить фиксированные мазки по Граму.
Выявить споры, зерна волютина и кислотоустойчивых бактерий соответствующими методами окраски.
Определить подвижность исследуемых бактерий.
Определить родовую принадлежность бактерий в готовых мазках, окрашенных по Романовскому − Гимзе.