- •Предисловие
- •Тема № 1. Правила работы и устройство микробиологической лаборатории. Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски
- •Организация микробиологической лаборатории
- •Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски
- •Исследование микроорганизмов в окрашенном состоянии
- •Окраска по Граму
- •Окраска кислотоустойчивых бактерий
- •Окраска спор
- •Окраска включений волютина
- •Обнаружение капсул у бактерий
- •Окраска по Романовскому – Гимзе
- •Тема № 2. Морфология бактерий. Ультраструктура бактериальной клетки
- •Морфология бактерий
- •Структура бактериальной клетки
- •Тема № 3. Физиология, биохимия бактерий. Питательные среды. Этапы выделения и идентификации чистых культур аэробных и анаэробных бактерий
- •Культивирование микроорганизмов в лабораторных условиях
- •Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий
- •Особенности культивирования облигатно-анаэробных бактерий
- •Краткая характеристика питательных сред
- •Тема № 4. Асептика, антисептика, стерилизация
- •Стерилизация
- •Соотношение показаний манометра и температуры
- •Дезинфекция
- •Асептика
- •Антисептика
- •Классификация дезинфицирующих и антисептических средств
- •Тема № 5. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы
- •Изучение действия уф-света на микроорганизмы
- •Диско-диффузионный метод
- •Фитонциды
- •Тема № 6. Количественное определение микроорганизмов
- •Количественное определение микроорганизмов методом непосредственного (прямого) подсчёта
- •Определение количества дрожжевых клеток в 1 г прессованных хлебопекарных дрожжей с помощью камеры Горяева
- •Определение количества микробных клеток фотометрическим методом
- •Определение числа клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха).
- •Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений).
- •Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объёма исходной суспензии (по Мак-Креди)
- •Тема № 7. Возбудители бактериальных кишечных инфекций
- •Эшерихии
- •Сальмонеллы
- •Тема № 8. Основы санитарной микробиологии
- •Основные понятия и термины санитарной микробиологии
- •Общая характеристика санитарно-показательных микроорганизмов
- •Первая группа санитарно- показательных микроорганизмов
- •Вторая группа санитарно- показательных микроорганизмов
- •Санитарно-микробиологическое исследование почвы
- •Санитарно-микробиологическое исследование воды
- •100 Мл питьевой воды)
- •Санитарно-микробиологическое исследование воздуха
- •Тема № 9. Санитарная микробиология пищевых продуктов. Пищевые токсикоинфекции и интоксикации
- •Санитарная микробиология мясных продуктов
- •Бактериологическое исследование консервов
- •Санитарно-микробиологическое исследование молока и молочных продуктов
- •Санитарно-микробиологическое исследование смывов с объектов внешней среды
- •Пищевые токсикоинфекции и интоксикации
- •Тестовые задания
- •Литература.
- •Оглавление
Соотношение показаний манометра и температуры
кипения воды
Показания манометра, атм |
Температура кипения воды оС |
Показания манометра, атм |
Температура кипения воды оС |
0 |
100 |
0,7 |
116 |
0,2 |
105 |
0,8 |
117 |
0,4 |
110 |
1,0 |
121 |
0,5 |
112 |
1,5 |
127 |
0,6 |
114 |
2,0 |
134 |
Основные используемые режимы стерилизации следующие: 15 – 30 мин. при избыточном давлении 0,5 атм (стерилизуют питательные среды с углеводами); 15-45 мин при избыточном давлении 1,0 атм (стерилизуют питательные среды без углеводов, воду, растворы, фильтры, посуду); 10 – 30 мин при избыточном давлении 1,5 атм (обеззараживают условно-патогенный материал).
Контроль режима стерилизации осуществляется с помощью химических тер-мотестов и искусственных биотестов.
Химические термотесты представляют собой вещества, изменяющие свой цвет или физическое состояние при стерилизации, в частности вещества, имеющие различную температуру плавления (табл. 2).
Таблица 2
Показатели температуры плавления порошков-индикаторов
-
Название химического вещества-индикатора
Температура плавления, оС
Название химического вещества-индикатора
Температура плавления, оС
Бензонафтол
110
Резорцин чистый
118
Антипирин
115
Бензойная кислота
121
На 100 г порошка индикатора прибавляют 0,01г сафранина, 0,005 г фуксина или метиленового синего.
Запаянные ампулы с порошком, смешанным с краской, помещают в стери-лизационную камеру. При достижении в камере определенной температуры порошок плавится, образуя сплав, окрашенный в цвет добавленной краски.
Бактериологический контроль режима стерилизации заключается в том, что в стерилизационную камеру помещают искусственные биотесты – пробирки с полосками марли, фильтрованной бумаги или шелковинками, зараженными микроорганизмами с известной устойчивостью к температурным воздействиям. На чашки с питательным агаром засевают 3-4 различных штамма споровых па-лочек из группы Bacillus mesentericus, выдерживающих кипячение в течение 2 ч. Посевы ставят в термостат на 48 ч., после чего их выдерживают при комнатной температуре в течение 5 суток. Затем культуры смывают с поверхности агара водой с помощью шпателя, сливают в колбочку со стерильными бусами и энер-гично встряхивают в течение 2-3 мин. Полученную взвесь микробов фильтруют через рыхлый ватный фильтр для удаления крупных частиц и разводят по стан-дарту до концентрации 2 млрд микробных клеток в 1 мл.
Кусочки марли или бельевой ветоши площадью около 1 см2 пропитывают микробной взвесью и раскладывают на дно пробирок, закрытых ватно-марле-выми пробками. Пробирки необходимо на несколько часов поставить в умерен-но теплое место (термостат, батарея центрального отопления) для того, чтобы биотесты проросли. После этого их можно хранить в лаборатории в течение года.
Зарубежные фирмы поставляют биотесты, представляющие собой полоски с нанесенными на них спорами одного или двух видов бактерий, со спорами из-вестной численности, со спорами и определенным количеством культуральной среды, суспензиями спор и т. д.
Биотесты закладывают в центральную часть каждого бикса или мешка, содер-жащих белье, перевязочный и другой материал, подлежащий стерилизации. После вскрытия бикса или мешка (во время работы) биотесты направляют в лабораторию.
В лаборатории в пробирку с биотестом заливают 5-10 мл сахарного бульона и посевы инкубируют в течение 48 ч. при 37 0С.
При наличии визуального роста готовят мазки или высевы на мясо-пептонный агар для идентификации культуры.
Стерилизация текучим паром (дробная стерилизация) — это обеспложива-ние объектов, разрушающихся при температуре выше 100 0С (питательные срды с аммиачными солями, молоко, желатин, крахмал некоторые углеводы). Обеспложивание проводят в паровом стерилизаторе при открытом спускном кране и незавинченной крышке или в аппарате Коха по 15-30 мин. в течение 3 дней подряд. При первой стерилизации погибают вегетативные формы микро-бов, некоторые споры при этом сохраняются и прорастают в вегетативные осо-би в процессе хранения питательных сред при комнатной температуре. После-дующая стерилизация обеспечивает достаточно надежное обеспложивание объекта.
Тиндализация — это стерилизация вещест, легко разрушающихся при вы-сокой температуре (витамины, аминокислоты); стерильность достигается пов-торным прогреванием объекта при температуре 60 0С по 1 часу ежедневно в течение 5-6 дней подряд.
Пастеризация — это обеспложивание многих пищевых продуктов (вино, пиво, соки), при этом достигается только частичная стерильность; споры микро-организмов не уничтожаются. Обеспложивание проводят при 65-80 0С в течение 10-60 мин, затем резко охлаждают. Последующее хранение при низкой температуре (4-5 0С) препятствует прорастанию спор и размножению оставшихся в продукте микроорганизмов.
Стерилизация ультрафиолетовыми лучами применяется для обеспложи-вания воздуха в микробиологических лабораториях, кондитерских цехах.
Ультрафиолетовые лучи (250 – 270 нм) используются для стерилизации центрифужных пробирок, наконечников для пипеток, материалов из термолабильной пластмассы. Время облучения определяется мощностью лампы, временем воздействия, степенью и видовым составом микроорганизмов загрязненного материала. Вегетативные формы более чувствительны к облучению, чем споры, которые в 3 – 10 раз более устойчивы. Ограничением при использовании данного метода стерилизации является низкая проникающая способность УФ-лучей и высокая поглощающая способность воды и стекла.
Рентгеновское и -облучение также эффективно для стерилизации пластмасс, пищевых продуктов, но требует строгого соблюдения правил безопасности. Наиболее чувствительны к -облучению вегетативные клетки бактерий, затем идут плесневые грибы, дрожжи, бактериальные споры и вирусы. В большинстве случаев для надежного уничтожения микроорганизмов достаточно дозы облучения 2,5 Мрад. -обучение используется для стерилизации антибиотиков, витаминов, гормонов, стероидов.
Радиационный метод применяют обычно на специальных установках при промышленной стерилизации изделий однократного применения.
Механические методы стерилизации
Фильтрование применяют в тех случаях, когда повышенная температура мо-жет резко повлиять на качество стерилизуемых материалов (питательные среды, сыворотки, антибиотики), а также для очистки бактериальных токсинов, фагов и различных продуктов жизнедеятельности бактерий. Как окончательный про-цесс он менее надежен, чем стерилизация паром, из-за большой вероятности прохождения микроорганизмов через фильтры.
Фильтры задерживают микроорганизмы благодаря поровой структуре их материала. Существуют два основных типа фильтров – глубинные и мембран-ные.
Глубинные фильтры состоят из волокнистых или гранулированных матери-алов, которые спрессованы, свиты или связаны в лабиринт проточных каналов. Частицы задерживаются в них в результате адсорбции и механического захвата в материале фильтра. Фильтры Шамберлана изготовляют из каолина с при-месью песка и кварца. Они имеют вид свечей с различными размерами пор и обозначаются L1, L2, L3 и т.д. Следует запомнить, что фильтры L5-L13 бактерий не пропускают. Для фильтра Беркефельда используют инфузорную землю. Размеры пор в порядке увеличения обозначаются буквами W, N, V.
Мембранные фильтры имеют непрерывную структуру; их получают из нитро-клетчатки, и захват ими частиц определяется, в основном, размером пор. В за-висимости от размера пор мембранные фильтры обозначают номерами 1-5 (диа-метры пор 350-1200 нм).
Фильтрацию материалов производят под вакуумом, который создают ваку-умным или водоструйным насосами. Фильтры Шамберлана и Беркефельда сое-диняют с вакуумной колбой Бунзена резиновыми трубками и перед фильтраци-ей стерилизуют в паровом стерилизаторе при 120 0С. Мембранные фильтры пос-ле предварительной стерилизации кипячением вставляют в аппарат Зейтца, состоящий из асбестовой пластинки, вмонтированной в металлическую ворон-ку, которую через резиновую пробку присоединяют к колбе Бунзена.
Контроль режима стерилизации
Для контроля режима стерилизации используют тест-культуру Bacillus stearothermophilus (споры погибают при 121 °С за 15 мин.).
Для контроля действия автоклава пользуются также физическим методом плавления: например, в автоклав помещают бензонафтол (температура плавления – 110 °С), антипирин (температура плавления – 113 °С), бензойную кислоту (температура плавления – 120 °С). Если температура в автоклаве доста-точна, вещества расплавляются и окрашиваются в цвет, соответствующий взятому красителю.