- •Предисловие
- •Тема № 1. Правила работы и устройство микробиологической лаборатории. Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски
- •Организация микробиологической лаборатории
- •Методы микроскопии. Техника приготовления микроскопических препаратов. Простые и сложные методы окраски
- •Исследование микроорганизмов в окрашенном состоянии
- •Окраска по Граму
- •Окраска кислотоустойчивых бактерий
- •Окраска спор
- •Окраска включений волютина
- •Обнаружение капсул у бактерий
- •Окраска по Романовскому – Гимзе
- •Тема № 2. Морфология бактерий. Ультраструктура бактериальной клетки
- •Морфология бактерий
- •Структура бактериальной клетки
- •Тема № 3. Физиология, биохимия бактерий. Питательные среды. Этапы выделения и идентификации чистых культур аэробных и анаэробных бактерий
- •Культивирование микроорганизмов в лабораторных условиях
- •Выделение и идентификация чистых культур аэробных и анаэробных бактерий
- •Особенности культивирования облигатно-анаэробных бактерий
- •Краткая характеристика питательных сред
- •Тема № 4. Асептика, антисептика, стерилизация
- •Стерилизация
- •Соотношение показаний манометра и температуры
- •Дезинфекция
- •Асептика
- •Антисептика
- •Классификация дезинфицирующих и антисептических средств
- •Тема № 5. Влияние факторов внешней среды на микроорганизмы
- •Изучение действия уф-света на микроорганизмы
- •Диско-диффузионный метод
- •Фитонциды
- •Тема № 6. Количественное определение микроорганизмов
- •Количественное определение микроорганизмов методом непосредственного (прямого) подсчёта
- •Определение количества дрожжевых клеток в 1 г прессованных хлебопекарных дрожжей с помощью камеры Горяева
- •Определение количества микробных клеток фотометрическим методом
- •Определение числа клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха).
- •Определение количества клеток высевом в жидкие среды (метод предельных разведений).
- •Наиболее вероятное количество клеток микроорганизмов в единице объёма исходной суспензии (по Мак-Креди)
- •Тема № 7. Возбудители бактериальных кишечных инфекций
- •Эшерихии
- •Сальмонеллы
- •Тема № 8. Основы санитарной микробиологии
- •Основные понятия и термины санитарной микробиологии
- •Общая характеристика санитарно-показательных микроорганизмов
- •Первая группа санитарно- показательных микроорганизмов
- •Вторая группа санитарно- показательных микроорганизмов
- •Санитарно-микробиологическое исследование почвы
- •Санитарно-микробиологическое исследование воды
- •100 Мл питьевой воды)
- •Санитарно-микробиологическое исследование воздуха
- •Тема № 9. Санитарная микробиология пищевых продуктов. Пищевые токсикоинфекции и интоксикации
- •Санитарная микробиология мясных продуктов
- •Бактериологическое исследование консервов
- •Санитарно-микробиологическое исследование молока и молочных продуктов
- •Санитарно-микробиологическое исследование смывов с объектов внешней среды
- •Пищевые токсикоинфекции и интоксикации
- •Тестовые задания
- •Литература.
- •Оглавление
Окраска по Граму
Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.
1.Окрасить мазок генцианвиолетом (2 мин., через фильтровальную бумагу).
2.Бумагу удалить, оставшуюся краску слить.
3.Окрасить мазок раствором Люголя (1 мин.).
4.Раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 с., осторожно покачивать стекло).
5.Тщательно смыть спирт водой.
6.Окрасить водным фуксином (2 мин.).
7.Промыть водой и высушить.
Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамполо-жительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного (рис.5). Способность окрашиваться в тот или другой цвет зависит от их химического состава. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют аро-матические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. В результате образуется прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта.
Успех окраски зависит от ряда причин и прежде всего от правильности обра-ботки спиртом. При длительном его воздействии краска может быть вымыта и из грамположительных бактерий. В таком случае в ходе дополнительной окрас-ки фуксином они примут красный цвет. Слишком кратковременное действие спирта не позволит выявить грамотрицательные бактерии.
Рисунок 5. Окраска по Граму. Фиолетовые стафилококки и красные вибрионы
Реактивы для окраски по Граму
1. Карболовый генцианвиолет
генцианвиолета 1 г
кислоты карболовой 2 г
спирта 96% 10 мл
воды дистиллированной 100 мл
Растереть в ступке генцианвиолет с карболовой кислотой, добавляя в начале спирт, а потом воду. Раствор выдержать сутки, профильтровать и использовать для окраски.
2. Раствор Люголя
калия йодистого 2 г
йода кристаллического 1 г
воды дистиллированной 300 мл
В небольшом объеме дистиллированной воды растворить йодистый калий, а затем кристаллический йод, после этого довести объем до 300 мл.
3. Спирт 96%
4. Водный фуксин Пфейффера
Приготовление красок
Фуксин готовят в виде концентрированного раствора Циля. Раствор обладает большой стойкостью при хранении. Его применяют при сложных методах окраски (окраска спор, кислотоустойчивых бактерий). Для простого окра-шивания используют фуксин Пфейффера (фуксин Циля, разведенный в 10 раз дистиллированной водой). Он нестоек, и готовят его для работы на один день.
Окраска кислотоустойчивых бактерий
Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, спиртам и щелочам. Это связано с наличием в кле-точной стенке и цитоплазме сравнительно большого количества липидов (воскоподобных веществ). Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными красками, поэтому применяют концентрированные растворы красок с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой тела микробных клеток, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии от бактерий, не обладающих этим свойством. Их окрашивают по методу Циля − Нильсена, разработанному с уче-том всех указанных особенностей.
Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.
1. Нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 мин.).
2. Бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (2-4 с.).
3. Тщательно промыть водой.
4. Окрасить леффлеровской синькой (3-5 мин.).
5. Промыть водой и высушить.
Кислотоустойчивые бактерии в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а остальные − синими.
Карболовый фуксин Циля
Фуксина основного 1 г
Спирта 96% 10 мл
Кислоты карболовой кристаллической 5 г
Воды дистиллированной 100 мл
Растереть в ступке фуксин с карболовой кислотой, спирт добавлять постепенно, а затем небольшими порциями влить дистиллированную воду.
Метиленовая синь по Леффлеру
Насыщенного спиртового раствора метиленового синего 30 мл
Воды дистиллированной 100 мл
1% водного раствора КОН 1 мл