Добавил:
Upload Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Основы микроб ГУсЭ.doc
Скачиваний:
34
Добавлен:
11.11.2019
Размер:
916.99 Кб
Скачать

Окраска по Граму

Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.

1.Окрасить мазок генцианвиолетом (2 мин., через фильтровальную бумагу).

2.Бумагу удалить, оставшуюся краску слить.

3.Окрасить мазок раствором Люголя (1 мин.).

4.Раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 с., осторожно покачивать стекло).

5.Тщательно смыть спирт водой.

6.Окрасить водным фуксином (2 мин.).

7.Промыть водой и высушить.

Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамполо-жительные – темно-фиолетового цвета и грамотрицательные – красного (рис.5). Способность окрашиваться в тот или другой цвет зависит от их химического состава. У грамположительных бактерий в клеточной стенке отсутствуют аро-матические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грамотрицательных, напротив, эти вещества содержатся в большом количестве. В результате образуется прочный химический комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, который не разрушается при кратковременном действии спирта. У грамотрицательных такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта.

Успех окраски зависит от ряда причин и прежде всего от правильности обра-ботки спиртом. При длительном его воздействии краска может быть вымыта и из грамположительных бактерий. В таком случае в ходе дополнительной окрас-ки фуксином они примут красный цвет. Слишком кратковременное действие спирта не позволит выявить грамотрицательные бактерии.

Рисунок 5. Окраска по Граму. Фиолетовые стафилококки и красные вибрионы

Реактивы для окраски по Граму

1. Карболовый генцианвиолет

генцианвиолета 1 г

кислоты карболовой 2 г

спирта 96% 10 мл

воды дистиллированной 100 мл

Растереть в ступке генцианвиолет с карболовой кислотой, добавляя в начале спирт, а потом воду. Раствор выдержать сутки, профильтровать и использовать для окраски.

2. Раствор Люголя

калия йодистого 2 г

йода кристаллического 1 г

воды дистиллированной 300 мл

В небольшом объеме дистиллированной воды растворить йодистый калий, а затем кристаллический йод, после этого довести объем до 300 мл.

3. Спирт 96%

4. Водный фуксин Пфейффера

Приготовление красок

Фуксин готовят в виде концентрированного раствора Циля. Раствор обладает большой стойкостью при хранении. Его применяют при сложных методах окраски (окраска спор, кислотоустойчивых бактерий). Для простого окра-шивания используют фуксин Пфейффера (фуксин Циля, разведенный в 10 раз дистиллированной водой). Он нестоек, и готовят его для работы на один день.

Окраска кислотоустойчивых бактерий

Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной устойчивостью к неорганическим кислотам, спиртам и щелочам. Это связано с наличием в кле-точной стенке и цитоплазме сравнительно большого количества липидов (воскоподобных веществ). Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными красками, поэтому применяют концентрированные растворы красок с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой тела микробных клеток, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии от бактерий, не обладающих этим свойством. Их окрашивают по методу Циля − Нильсена, разработанному с уче-том всех указанных особенностей.

Окраску необходимо проводить в следующей последовательности.

1. Нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок, покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 мин.).

2. Бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 5% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (2-4 с.).

3. Тщательно промыть водой.

4. Окрасить леффлеровской синькой (3-5 мин.).

5. Промыть водой и высушить.

Кислотоустойчивые бактерии в результате такой окраски становятся рубиново-красными, а остальные − синими.

Карболовый фуксин Циля

Фуксина основного 1 г

Спирта 96% 10 мл

Кислоты карболовой кристаллической 5 г

Воды дистиллированной 100 мл

Растереть в ступке фуксин с карболовой кислотой, спирт добавлять постепенно, а затем небольшими порциями влить дистиллированную воду.

Метиленовая синь по Леффлеру

Насыщенного спиртового раствора метиленового синего 30 мл

Воды дистиллированной 100 мл

1% водного раствора КОН 1 мл