Краткая характеристика питательных сред

Питательные среды содержат различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микро-организмов в лабораторных или промышленных условиях. Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые ката-лизируют метаболические процессы микробной клетки. Сухие питательные сре-ды получают на основе достижений современной биотехнологии. Для их при-готовления используют непищевое сырье. По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими и плотными.

Категории питательных сред по назначению

На универсальных (основных) средах хорошо растут многие виды пато-генных и непатогенных бактерий. К ним относятся МПБ, МПА.

Элективные (селективные) среды предназначены для избирательного рос-та определенных микроорганизмов. Селективные среды позволяют направ-ленно отбирать из исследуемого материала определенные виды бактерий. К ним относятся среда Мюллера, селенитовая, Раппопорт.

Дифференциально-диагностические среды применяют для изучения био-химических свойств. Эти среды позволяют отличать одни виды бактерий от других по характеру их ферментативной активности или культуральным про-явлениям. К ним относятся среды Эндо, Левина, Плоскирева, Гисса и др.

Общие требования к питательным средам

Питательные среды предназначены для накопления, выделения, изучения и сохранения микроорганизмов. По своей сущности питательные среды являются искусственной средой обитания микробов, поэтому при их составлении учиты-вают как потребности микроорганизмов в веществах, необходимых для жизни, так и физико-химические условия, в которых микроорганизмы могут осуществ-лять обмен между клеткой и средой.

Для обеспечения разнообразных типов метаболизма микроорганизмов пита-тельные среды должны соответствовать следующим требованиям.

1.Среда должна содержать все элементы, из которых строится клетка: макро-элементы (углерод, азот, кислород, сера, фосфор, калий, кальций, магний, же-лезо) и микроэлементы (марганец, молибден, цинк, медь, кобальт, никель, вана-дий, хлор, натрий, кремний, и др.). Все элементы должны находиться в удобо-усвояемых конкретным микроорганизмом соединениях. Источником углерода могут быть разнообразные органические соединения: углеводы, многоатомные спирты, органические кислоты, аминокислоты, белки и др. Источником азота служат аммонийные соединения, аминокислоты, пептиды, белки. Источником остальных макроэлементов являются неорганические соединения − соли фос-форной и других кислот. Микроэлементы поступают в питательную среду с ор-ганическими субстратами, солями и водой. Витамины (особенно группы В) и другие факторы роста вносят в среду в составе органических субстратов или в виде чистых веществ.

2. Среда должна иметь достаточную влажность (не менее 20 % воды).

3. Концентрация солей в среде должна обеспечивать изотонию, то есть соот-ветствовать концентрации солей в микробной клетке (для большинства микро-организмов − 0,5 %; для галофильных − 3 %).

4. Концентрация водородных ионов (рН) среды должна быть оптимальной для выращиваемого микроорганизма (диапазон рН 4,5-8,5).

5. Окислительно-восстановительный потенциал (Еh) среды должен соответ-ствовать потребностям микроорганизма: для анаэробов − 0,120-0,060 В, для аэ-робов − более 0,080 В.

6. Питательная среда должна быть стерильной.

Типы питательных сред

По составу питательные среды могут быть синтетическими и натуральными. Питательные среды являются синтетическими, если содержат только химически чистые соединения в установленных дозировках, то есть состав их полностью известен. Достоинством таких сред являются стандартность и воспроизводи-мость. Однако только для немногих патогенных бактерий имеются синтетичес-кие среды. Их применяют главным образом для экспериментального изучения метаболизма микробов.

Для практических исследований широко используют натуральные среды. Натуральные (естественные) питательные среды состоят из продуктов живот-ного и растительного происхождения и имеют неопределенный химический состав.

Различают питательные среды общего назначения (универсальные) и специ-альные питательные среды. Питательные среды общего назначения пригодны для выращивания многих видов микроорганизмов и применяются в качестве ос-новы для приготовления специальных питательных сред. К ним относятся, например, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, бульон Хоттингера, агар Хоттингера и другие. Специальные питательные среды предназначены для избирательного культивирования определенных видов микроорганизмов, изуче-ния их свойств и хранения.

Различают следующие виды специальных сред: элективные (избирательные), дифференциально-диагностические, консервирующие. Избирательность пита-тельной среды для определенных видов микробов достигается путем создания оптимальных для них условий (учитываются рН, Еh, концентрация солей, сос-тав питательных веществ), то есть положительной селекцией, или путем добав-ления в среду веществ, угнетающих другие микробы (желчь, азид натрия, теллурит калия, антибиотики и др.), то есть отрицательной селекцией. Дифференцирующие свойства питательной среды создаются внесением суб-страта, к которому определяется отношение микроба (например, сахаров, ами-нокислот и др.), внесением соответствующих индикаторов (например, рН-индикаторов бромтимолблау, фуксина; Еh-индикаторов).

По консистенции питательные среды могут быть жидкими, полужидкими (0,2-0,7 % агара) и плотными (1,5-2 % агара). Сухие питательные среды, вы-пускаемые промышленностью, представляют собой форму консервации сред.

Для обеспечения микрообъемной технологии биохимической идентификации микроорганизмов выпускаются коммерческие микро-тест-системы. Они пред-ставлены двумя группами, различающимися особенностями содержания суб-страта реакции: первая − в питательной среде; вторая − в шаблоне-носителе. Тест-системы первой группы в микрообъемных лунках полистироловых плас-тин содержат дегидрированные питательные среды, стабилизированные поливиниловым спиртом, например, API-20E, Enterotest 1 и 2, отечественные ПБДЕ и MMTE 1 и Е 2. Тест-системы второй группы имеют субстрат и инди-катор в бумажном или полимерном шаблоне-носителе, например, Micro-ID, Minitek. Разработаны также тест-системы на основе жидких дифференциальных сред, которые можно изготавливать непосредственно в лабораториях. По ре-зультатам биохимических тестов устанавливается вид микроорганизма. Это де-лается с помощью таблиц идентификации, аналитического каталога кодов или приборов автоматизированных микробиологических систем биохимической идентификации микроорганизмов.

В силу способности повышать скорость исследования, а также высокой эко-номичности микрообъемные тест-системы имеют широкое применение в работе лабораторий.

Приготовление питательных сред

Компоненты питательных сред

Для натуральных питательных сред используют животные, растительные и микробные продукты: мясо, рыбную муку, молоко, яйца, кровь, картофель, дрожжи и др. Из них готовят полуфабрикаты: настои и экстракты (мясная вода, дрожжевой экстракт), ферментативные и кислотные гидролизаты (пептон, пере-вар Хоттингера, перевар казеина и др.). Настои и экстракты являются источни-ком факторов роста; гидролизаты − источником аминокислот и других органи-ческих питательных веществ. Минеральные соли вносят в следующих соотно-шениях: NaCl − 5,0 г/л; КН₂РО₄ − 0,2-0,5 г/л; MgSO₄х7Н₂О − 0,1-0,2 г/л; остальные соли − 0,001 г/л. Для специальных сред используют: многоатомные спирты (маннит, инозит и др. ), аминокислоты, витамины , кровь , сыворотку крови, молоко и др. Из индикаторов рН чаще применяют индикатор Андреде (кислого фуксина − 0,5 г; раствора 1N NaOН − 17 мл; дистиллированной во-ды − 100 мл) или индикатор Кларка (1,5% спиртового раствора фенолового красного, метиленового красного, бромтимолового синего и др.). В качестве уплотнителя питательных сред используют агар-агар или желатин. Агар-агар − полисахарид, получаемый из морских водорослей − способен образовывать в воде гель, плавящийся при 80-86 ^оС и застудневающий при 40-45 ^оС, который не расщепляется большинством видов микроорганизмов. Желатин — белок, полу-чаемый из кожи и костей. Желатиновый гель плавится при 32-34 ^оС, образует студнеобразную массу при 26-28 ^оС (то есть при температуре инкубации 37 ^оС находится в жидком состоянии); расщепляется многими видами микроорганиз-мов. Поэтому желатин применяют редко.

Этапы приготовления питательных сред

Согласно прописи питательной среды в дистиллированную воду вносят необ-ходимые компоненты и растворяют при нагревании. При разведении белковых гидролизатов концентрация аминного азота должна оставлять 1,0-1,2 г/л, об-щего − 2,5-3,0 г/л; рН среды определяют с помощью индикаторных бумажек или электропотенциометров (с учетом того, что после стерилизации рН среды снизится на 0,2). Фильтруют жидкие и желатиновые среды через фильтроваль-ную бумагу; среды с агаром (в горячем состоянии) − через ватно-марлевый фильтр. При необходимости осветляют питательную среду посредством обра-ботки белком куриного яйца, сывороткой или осаждением. Разливают среду в колбы, флаконы, пробирки. Используют чистую нестерильную посуду, если среда подлежит стерилизации при 120 ^оС, или стерильную посуду, если среда требует стерилизации текучим паром (100 ^оС) или при 112 ^оС. Закрывают по-суду со средой ватно-марлевыми пробками с бумажными колпачками. В зави-симости от состава среды стерилизуют различными способами. Агаровые сре-ды, не содержащие углеводов и нативного белка, а также синтетические среды стерилизуют в автоклаве при 115-120 ^оС в течение 15-20 мин. Среды, содержа-щие углеводы, молоко, желатин, стерилизуют текучим паром при 100 ^оС дробно или в автоклаве при 112 ^оС в течение 15 мин. Среды, содержащие нативный бе-лок, мочевину, стерилизуют фильтрованием или добавляют стерильные компо-ненты (кровь, сыворотку и др.) в стерильную основу среды. Готовые стериль-ные питательные среды подвергают контролю на стерильность путем выдержи-вания в термостате при 37 ^оС в течение 1-3 суток.

В полевых условиях проще готовить питательные среды из сухих (консерви-рованных) питательных сред. Навеску сухой среды, указанную на этикетке, вно-сят в дистиллированную или водопроводную воду и кипятят до полного раство-рения порошка. Затем разливают среду в стерильные колбы, пробирки и стери-лизуют. Некоторые среды (например, Эндо, Плоскирева, Левина) можно ис-пользовать без стерилизации.

Техника приготовления некоторых полуфабрикатов и питательных сред общего назначения

Мясной настой (мясная вода)

Для приготовления настоя употребляют свежее говяжье мясо. Мышцы от-деляют от костей, освобождают от жира и соединительной ткани, измельчают в мясорубке, заливают водой из расчета 2 л воды на 1 кг мясного фарша и остав-ляют на 18-20 ч. при температуре 8-10 ^оС. Затем настой вместе с мясом нагре-вают до кипения и кипятят в течение 30 мин. Удаляют всплывающий на поверх-ность жир, доливают дистиллированной водой до первоначального объема, от-деляют настой от фарша через сито или марлю, фильтруют через ватный фильтр. Настой, не стерилизуя, употребляют для приготовления бульона или для хранения разливают в бутылки и стерилизуют при 120 ^оС в течение 30 мин. В мясном настое содержится азота общего − 2,00 г/л, азота аминного − 0,6 г/л.

Гидролизат (перевар) по Хоттингеру

Мясо (1 кг) нарезают кусочками примерно по 1-2 см³, опускают небольшими порциями в кастрюлю с двойным количеством (по отношению к мясу) кипящей воды, кипятят 15-20 мин., пока мясо не станет серым, затем извлекают из жид-кости шумовкой и пропускают через мясорубку. В оставшейся жидкости уста-навливают рН 8,0, опускают в нее фарш и охлаждают в кастрюле до 40 ^оС, после чего добавляют поджелудочную железу (очищенную от жира, соедини-тельной ткани и дважды пропущенную через мясорубку) в количестве 10 % от взятой жидкости (на 1 л жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в коли-честве 0,5 % и выше в зависимости от его активности. Хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают через 30 мин. (отсутствие сдвига реакции в кислую сторону указывает на недоброкачественость фермента). После уста-новления рН смесь переливают в бутыль с плотной резиновой пробкой с таким расчетом, чтобы 1/3 бутылки оставалась свободной. Добавляют 1-3 % хлоро-форма (в холодное время года меньше, чем в теплое), закрывают бутыль проб-кой и несколько раз встряхивают, после чего на минуту вынимают пробку для освобождения от избытка паров хлороформа. Через 1-2 ч. после добавления фермента опять проверяют реакцию и устанавливают рН 7,4-7,6. Смесь остав-ляют на 10-16 дней при комнатной температуре или 7-10 дней при 37 ^оС. Первые 3-4 дня переваривания ежедневно проверяют и исправляют реакцию, а также встряхивают перевар не менее трех раз в сутки. В дальнейшем проверку проводить нецелесообразно, а встряхивать можно реже. За 1-2 дня до окончания переваривания прекращают встряхивание, чтобы перевар отстоялся. Окончание переваривания характеризуется следующими признаками: на дне бутылки соби-рается пылевидный осадок, жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет, реакция на триптофан с бромной водой положительная (максимальное содержание триптофана 2,00-3,00 г/л), в гидролизате содержится 11,00-12,00 г/л азота, 7,00-9,00 г/л аминного азота. По окончании гидролиза перевар фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, разливают в бу-тылки, колбы и стерилизуют при 120 ^оС в течение 30 мин. для хранения впрок.

Мясо-пептонный бульон

К мясному настою добавляют 1 % пептона, 0,5 % химически чистого натрия хлорида. Смесь кипятят при постоянном помешивании 15-20 мин., устанавли-вают рН 7,2-7,4, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы и про-бирки, стерилизуют при 120 ^оС в течение 20 мин. Содержание аминного азота в готовой среде − 1,2 г/л.

Бульон Хоттингера

К 100-200 мл перевара Хоттингера добавляют 800-900 мл дистиллированной воды (в зависимости от концентрации аминного азота в переваре), затем добав-ляют 5 г хлористого натрия, 0,2 г дигидрофосфата натрия. Устанавливают рН 7,4-7,6, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при 120 ^оС в течение 20 мин. Содержание аминного азота в готовой среде − 1,00-1,20 г/л.

Мясо-пептонный агар

К 1 л мясо-пептонного бульона добавляют 15-25 г (1,5-2,5 %) мелко нарезанного агар-агара. Кипятят, перемешивая, до полного растворения агара. Устанавливают рН 7,4-7,6. Фильтруют, разливают в колбы или пробирки, стерилизуют при 120 ^оС в течение 20 мин.

Агар Хоттингера

К 1 л бульона Хоттингера добавляют 15-25 г (1,5-2,5 %) мелко нарезанного агар-агара. Кипятят, перемешивая, до полного растворения агара. Устанавливают рН 7,4-7,6. Фильтруют, разливают в колбы или пробирки, сте-рилизуют при 120 ^оС в течение 20 мин.

Желточно-солевой агар для выделения стафилококков

Готовят мясо-пептонный агар рН 7,2-7,4) с содержанием 10% хлорида натрия. После разлива во флаконы по 100-200 мл стерилизуют в автоклаве в течение 20 мин при температуре 120⁰ С. Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 45-50⁰ С и добавляют 20% (по объёму) стерильной желточной взвеси (1 желток куриного яйца на 150 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия). Среду быстро перемешивают и разливают в чашки.

Среда Эндо –дифференциально-диагностическая среда для бактерий кишечной группы (готовится непосредственно перед употреблением).

К 100 мл МПА (рН 7,6) при температуре 70⁰ С асептично добавляют 5 мл 20% раствора лактозы и смесь 0,5 мл насыщенного раствора основного фуксина с 1,25 мл свежеприготовленного 10% раствора сульфита натрия.

Среды Гисса с углеводами для выделения сбраживания углеводов микроорганизмами.

Пептон-10 г, натрия хлорид-5 г, углевод-10 г, реактив Андреде-10 мл, дистилированная вода до 1000 мл. Разливают в пробирки с поплавками; рН после стерилизации 7,2-7,4.

Реактив Андреде 0,5 г кислого фуксина растворяют в 100 мл дистилированной воды, прибавляют 16,4 мл 1 н раствора гидроксида натрия, стерилизуют 5 мин при 100⁰ С и хранят в темном месте во флаконе с притертой пробкой. Приготовленный реактив должен иметь соломенно-жёлтый цвет.

Среда Сабуро -для культивирования грибов.

Пептон -10 г, глюкоза -10 г, агар-агар-20 г, дистилированная вода до 1000 мл.

Контроль питательных сред по биологическим и физико-химическим показателям

Бактериологическому контролю подлежат все серии питательных сред про-мышленного производства и все партии сред, приготовленных в лаборатории. В качестве тест-культур используют типовые или местные штаммы бактерий, ти-пичные по всем признакам, в гладкой форме. Тест-культуры хранят в лиофиль-но высушенном состоянии или в столбике полужидкого питательного агара. В дальнейшем перед использованием высевают на питательный агар и для полу-чения необходимых посевных доз разводят десятикратно стерильным 0,85% раствором натрия хлорида исходную взвесь культуры до концентрации 10⁹ КОЕ в 1 мл. Определяют следующие биологические показатели питательной среды: чувствительность (ростовую), ингибирующие свойства, дифференцирующие свойства, скорость роста бактерий на среде, воспроизводимость.

Чувствительность питательной среды определяют по минимальному коли-честву колониеобразующих единиц (КОЕ) бактерий, обеспечивающих появ-ление роста колоний на среде, или другим способом − по максимальному де-сятикратному разведению культуры из исходной концентрации 10 ЕД мутности (по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л. А. Тарасевича), обеспечива-ющему появление роста бактерий на всех засеянных чашках Петри. Ингибирующие свойства среды оценивают как степень подавления прочей микрофлоры по величине посевной дозы в КОЕ, полностью подавляемой на среде, или по отношению количества выросших колоний бактерий к расчетному количеству посеянных бактерий. Дифференцирующие свойства сред изучают путем посева испытуемых видов бактерий в смеси с ассоциантами с последую-щим определением четкости дифференциации колоний искомых бактерий от ассоциантов. Специфичность дифференцирующего свойства среды выявляют по отсутствию этого свойства у прочих видов бактерий, кроме искомых. Скорость роста бактерий на среде устанавливают по минимальному времени инкубации посевов (в часах), в течение которого обеспечивается четкий, видимый невоору-женным глазом, рост культуры (для селективных сред) или формирование ко-лоний с типичными дифференциальными признаками. Воспроизводимость био-логических показателей сред оценивают по частоте одинаковых результатов (в процентах) при повторных использованиях сред с теми же штаммами бактерий. Контроль различных питательных сред по биологическим показателям проводят по конкретным методикам и нормативам, руководствуясь официальными доку-ментами.

Физико-химический контроль питательных сред в практике лабораторий осу-ществляют по показателям рН, rH, содержанию аминного азота. Прочие по-казатели изучают обычно при промышленном производстве питательных сред. Для определения рН и rH сред используют рН-метры, индикаторные бумажки, а также различные химические индикаторы рН и rН, вносимые в питательные среды. Содержание аминного азота изучают методом рН-метрического формо-лового титрования питательных сред по ГОСТу.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Метаболизм как совокупность биохимических реакций, протекающих в бактериальной клетке, две стороны метаболизма.

2. Питание бактерий.

3. Классификация бактерий по типу питания, источникам энергии.

4. Основные механизмы питания бактерий.

5. Классификация бактерий по типу дыхания.

6. Рост и размножение бактерий.

7. Фазы размножения популяции бактерий в жидкой питательной среде.

8. Основные группы ферментов бактерий и их классификация.

9. Факторы роста.

10. Этапы выделения чистой культуры бактерий.

11. Определение микробиологических терминов: «вид», «штамм», «клон», «колония», «чистая культура».

12. Классификация питательных сред.

13. Требования к питательным средам.

14. Методы стерилизации питательных сред.

15. Способы культивирования бактерий.

16. Методы выделения чистой культуры аэробных бактерий.

17. Методы выделения чистой культуры анаэробных бактерий.

18. Определение культуральных и биохимических свойств бактерий в целях идентификации и диагностики.

РАБОТА ПОД РУКОВОДСТВОМ ПРЕПОДАВАТЕЛЯ

1. Освоение техники посева бактериальной петлей, иглой, пипеткой, шпателем.

2. Приготовление основных жидких и плотных питательных сред.

3. Определение показателя рН мясо-пептонного бульона.

4. Определение биохимических свойств микроорганизмов.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Из исследуемого материала приготовить мазок, окрасить по Граму или другим методом и микроскопировать.

2. Произвести посев исследуемого материала на искусственные питательные среды.

3. Нарисовать схему основных этапов выделения чистой культуры бактерий.

4. Идентифицировать выделенные изолированные колонии по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам.

5. Сделать посев изолированных колоний микроорганизмов на питательные среды с целью получения чистой культуры.