6.8.2. Электросекреторное сопряжение

 

В соответствии с квантовой теорией выделения медиаторов, если мембранный потенциал пресинаптического окончания равен потенциалу покоя, вероятность того, что тот или иной пузырек в тот или иной момент времени подвергнется экзоцитозу и его содержимое высвободится в синаптическую щель, довольно мала. Действительно, спонтанное опорожнение пузырьков происходит редко и случайным образом, однако при деполяризации пресинаптической мембраны вероятность выброса квантов медиатора резко возрастает. В этом можно убедиться на примере увеличения частоты МПКП при постепенной деполяризации мембраны (рис. 6–33).

 

Рис. 6.33. Увеличение частоты МПКП под действием электрического раздражителя. При деполяризации пресинаптического окончания, возникающей при подаче импульса тока (внизу), вероятность высвобождения медиатора увеличивается. Об этом свидетельствует возрастание частоты МПКП (вверху). (Katz,Miledi,1967.)

 

Влияние мембранного потенциала пресинаптического окончания на выделение медиатора было исследовано Бернардом Катцем и Рикардо Миледи на сверхкрупном синапсе гигантского аксона кальмара (рис. 6–34).

 

Рис. 6.34. Взаимосвязь между деполяризацией пресинаптического окончания и выделением медиатора в гигантском синапсе кальмара. А. Деполяризация мембраны пресинаптического волокна при импульсном введении тока через внутриклеточный микроэлектрод. Б. Запись пре– и постсинаптических потенциалов с помощью двух регистрирующих микро–электродов. Амплитуда импульса, вызывающего деполяризацию пресинаптического окончания, возрастает от а к в. В.  При данной концентрации Са2+ во внеклеточной среде увеличение степени деполяризации пресинаптической мембраны приводит к повышению выделения медиатора и, следовательно, амплитуды постсинаптического потенциала. Снижение [Са2+]0сопровождается уменьшением этого потенциала. (Katz, Miledi, 1966, 1970.)

 

 

Благодаря большим размерам этого синапса можно было ввести микроэлектроды как в пресинаптическое окончание, так и в постсинаптическую клетку рядом с синаптической областью. Это позволяло одновременно подавать ток и регистрировать мембранный потенциал, что на большинстве других синапсов осуществить было невозможно из–за малых размеров пресинаптических окончаний. Активация натриевых каналов в этих опытах подавлялась тетродотоксином (разд. 5.6.4), а калиевых – ТЭА (разд. 5.6.5). Благодаря этому при деполяризации пресинаптической мембраны не возникал ПД (рис. 6–34). С помощью третьего микроэлектрода записывались постсинаптические потенциалы, служащие высокочувствительным «микрохимическим датчиком» медиатора, выбрасывающегося пресинаптическим окончанием. В этих опытах были получены следующие результаты (рис. 6–34 Б и В).

1. Деполяризация пресинаптической мембраны приводила к выделению медиатора (о чем свидетельствовала деполяризация постсинаптической мембраны), хотя естественный механизм запуска этого выделения – ПД – был подавлен.

2. Амплитуда  постсинаптического  потенциала (пропорциональная количеству выделившегося медиатора) увеличивалась при повышении степени деполяризации пресинаптической мембраны.

3. При данном уровне деполяризации пресинаптической мембраны постсинаптический потенциал был меньше, если концентрация кальция во внеклеточной среде снижалась.

Когда пресинаптическое окончание деполяризовалось до уровня кальциевого равновесного потенциала Е_Са, поступление в это окончание Ca²⁺ по соответствующим каналам прекращалось. В этих условиях выделение медиатора не происходило и  восстановить его можно было, лишь скачкообразно, изменив мембранный потенциал от Е_Са до уровня покоя. При этом для ионов Са²⁺ возникал высокий электрохимический градиент, и они успевали создать кратковременный входящий ток до того, как кальциевые каналы в ответ на реполяризацию закрывались.

Связь между входом Са²⁺ и выделением медиатора была продемонстрирована на гигантском синапсе  аксона  кальмара  методом  регистрации люминесценции экворина – кальцийчувствительного белка, экстрагируемого из тканей медузы. Этот белок вводили в пресинаптическое окончание, записывали пре– и постсинаптические мембранные потенциалы и регистрировали люминесценцию экворина в ответ на связывание его с входящим в пресинаптическое окончание Са²⁺ (рис. 6–35). В том случае, если в пресинаптическое волокно подавался деполяризующий ток, постсинаптические потенциалы регистрировались лишь тогда, когда одновременно наблюдалась люминесценция экворина, свидетельствующая о входе Са²⁺ в пресинаптическое волокно.

 

Рис. 6.35. Роль Са2+ в электросекреторном сопряжении. В данном эксперименте натриевые и калиевые каналы гигантского синапса кальмара блокировали соответственно ТТХ и ТЭА. В пресинаптическое волокно вводили калъцийчувствительное вещество экворин и подавали деполяризующий импульс тока. С помощью микроэлектродов записывали пре– и постсинаптические потенциалы. В правой части рисунка представлена реакция на раздражение пресинаптического волокна слабым  и сильным токами. Нарастание постсинаптического потенциала, вызываемого, очевидно, выделением медиатора, совпадает с увеличением интенсивности люминесценции экворина в пресинаптическом окончании; это свидетельствует о входе в окончание ионов Са2+ . (Из работы Llinas, Nicholson, 1975.)

 

 

В пользу того, что для выделения медиатора из пресинаптического волокна нервно–мышечного синапса под действием потенциала действия необходим Са²⁺ , говорит тот факт, что в условиях, когда вход этого иона в волокно затруднен (например, при низкой концентрации Са²⁺ или наличии конкурирующих ионов типа Mg²⁺ или La³⁺ во внеклеточной среде), выход медиатора подавляется. Наконец, показано, что медиатор выбрасывается из пресинаптического окончания гигантского синапса кальмара в ответ на микроинъекции в это волокно ионов Са²⁺ .

Итак, все эти факты говорят о том, что для выделения из пресинаптического окончания медиатора необходимы ионы Са²⁺, входящие в это окончание в момент пробегания по нему нервного импульса. Полагают, что внутриклеточный Са²⁺ участвует в слиянии синаптических пузырьков с внутренней поверхностью клеточной мембраны нервного окончания или в каких–то еще стадиях экзоцитоза. Недавно был найден еще один ключ к разгадке роли Са²⁺ в экзоцитозе синаптических пузырьков: оказалось, что этот процесс стимулируется агентами, усиливающими активность фосфорилирующего фермента – протеинкиназы С (разд. 9.3). С другой стороны, известно, что ионы Са²⁺ также активируют этот фермент. Значит, один из возможных способов участия Са²⁺ в процессе экзоцитоза может состоять в облегчении фосфорилирования некоего белка, необходимого (в фосфорилированном состоянии) для запуска этого процесса.

Данные, полученные с применением разнообразных подходов на различных синапсах (в том числе на нервно–мышечном соединении лягушки и гигантском аксоне кальмара), свидетельствуют о том, что выделение медиатора может запускаться в том случае, когда с каждым рецепторным участком связывается более одного иона Са^2 +. Дело в том, что этот выход медиатора пропорционален числу ионов кальция, поступающих в окончание, в степени п (где п в зависимости от ткани может достигать 4). Иными словами, если п = 4 (как, например, в нервно–мышечном соединении лягушки), то при повышении [Ca²⁺]_i вдвое выход медиатора увеличивается в 16 раз (2⁴ = 16), при повышении [Са²⁺]_i втрое – в 81 раз (3⁴ — 81) и т. д. Значит, можно представить себе, что для инициации экзоцитоза с некоей молекулой в пресинаптическом окончании должны связаться до четырех ионов кальция. Что это за молекула – пока неясно.