6.6.6. Пресинаптическое торможение

 

В основе еще одной разновидности торможения нейронов лежит выделение тормозного медиатора из окончания, расположенного на пресинаптическом окончании возбуждающего аксона (рис. 6–27). В этом случае пресинаптическое возбуждающее окончание служит постсинаптической структурой для тормозного окончания. При таком пресинаптическом торможении не подавляется действие возбуждающего медиатора на постсинаптическом уровне, но снижается количество этого медиатора, выделяющегося из возбуждающего окончания. В ряде случаев при пресинаптическом торможении медиатор повышает проницаемость мембраны возбуждающего пресинаптического окончания для К⁺ или Cl¯, в результате чего уменьшается амплитуда ПД, поступающего в это окончание, и, следовательно, количество выделяемого им медиатора. Появляется также все больше данных о том, что во многих случаях при пресинаптическом торможении тормозный медиатор блокирует или инактивирует пресинаптические кальциевые каналы и они становятся менее чувствительными к деполяризации. Поскольку же выделение медиатора связано с поступлением Са²⁺ в окончания (разд. 6.6), уменьшение количества этого иона сопровождается снижением уровня высвобождающегося медиатора. Однако независимо от конкретных механизмов пресинаптическое торможение сводится к тому, что на постсинаптическую (для возбуждающего окончания) клетку действует меньшее количество медиатора и постсинаптический потенциал становится меньше.

 

Рис. 6.27. Структуры, обеспечивающие пресинаптическое торможение в мышцах ракообразных. Тормозной нейрон образует синапс на пресинаптических окончаниях возбуждающего двигательного волокна. При выделении тормозного медиатора проницаемость этого волокна для калия и хлора увеличивается, что приводит к уменьшению амплитуды ПД в этом волокне и, следовательно, уменьшению количества выделяемого окончанием медиатора. В том же случае, когда тормозное волокно оканчивается непосредственно на мышечной клетке, наблюдается постсинаптическое торможение, (Lang, Atwood, 1973.)

 

 

Пресинаптическое торможение было обнаружено у многих животных. Его значение для интегративной деятельности ЦНС позвоночных мы рассмотрим позже. Кроме того, оно выявлено в нервно–мышечном соединении ракообразных (рис. 6–27), где ветвления аксонов, образующих тормозные окончания на мышечных волокнах, посылают также веточки к окончаниям возбуждающих аксонов.

 

6.7. Постсинаптические рецепторы и каналы

 

Как мы уже знаем, когда медиатор взаимодействует с постсинаптической мембраной, он вызывает изменение (как правило, повышение) ее проницаемости для определенных ионов. При таком взаимодействии должны происходить два основных процесса.

1. Медиатор должен связываться с молекулой рецептора в постсинаптической мембране.

2. Взаимодействие   медиатора   с   рецептором должно приводить к временному открыванию (реже – к закрыванию) соответствующего ионного канала. При этом сам рецептор может располагаться отдельно от канала либо представлять собой его составную часть (или части).

 

Когда при связывании медиатора с рецептором канал активируется и открывается, через него проходит кратковременный ток. В обычных условиях в мембране происходит суммирование многих таких токов через одиночные каналы. В результате, когда в пресинаптическое окончание поступает ПД и из него выделяются десятки, сотни или тысячи молекул медиатора, через постсинаптическую мембрану вытекает достаточно мощный суммарный синаптический ток. Многое из того, что мы знаем о всех этих механизмах, было получено при изучении никотинчувствительных АцХ–активируемых каналов. Эти каналы, в частности, отвечают за постсинаптические токи в двигательной концевой пластинке.

 

6.7.1. АцХ–активируемый канал

 

Выделить, идентифицировать и изучить то вещество, которое связывает медиатор и при этом вызывает открывание ионного канала, отнюдь не просто. Дело в том, что таких воротных молекул по сравнению с общим числом белковых молекул в мембране довольно мало. В решении этой проблемы ученым помогли два случайных обстоятельства. Во–первых, оказалось, что на поверхности электрических пластинок (составных частей мощных электрических органов некоторых пластиножаберных и костистых рыб, представленных плоскими клетками, которые развиваются в эмбриональном периоде из мышечной ткани) имеется большое количество никотинчувствительных АцХ–рецепторов. Эти рецепторы удалось выделить химическими методами и получить их в достаточно большом количестве. Во–вторых, было обнаружено вещество α–бунгаротоксин (дополнение 6–3), обладающее способностью необратимо связываться с АцХ–рецептором. Пометив его радиоактивной меткой, удалось локализовать, идентифицировать и выделить АцХ–рецептор. Биохимическое выделение АцХ–рецептора показало, что он идентичен каналу, активируемому АцХ, вернее, рецептор, с которым связывается молекула АцХ, представляет собой составную часть этого канала.

АцХ–активируемый канал образован пятью белковыми субъединицами. Две из них – α–субъединицы – идентичны, а остальные три – β–, γ– и δ–субъединицы – различаются (рис. 6–28). Их мол. масса варьирует от 40 000 до 65 000, а в целом они образуют трубчатую структуру с общей мол. массой около 250 000. Эти данные хорошо согласуются с размерами каналообразных структур, которые (по результатам электронно–микроскопических исследований) пронизывают мембрану. Каналы выступают из мембраны с обеих сторон, причем над наружной ее поверхностью возвышается воронкообразная структура, образующая вход в канал.

Рецепторный участок канала располагается на наружной поверхности мембраны. Впервые это было показано в опытах, в которых введение АцХ в мышцу рядом с концевой пластинкой не вызывало каких–либо изменений потенциала. Сначала было неясно, какая именно молекула или молекулы связывают АцХ, т. е. служат холинорецептором АцХ–активируемого канала. Теперь известно, что каждая из двух α–субъединиц канала содержит участок связывания АцХ. Если к обоим этим участкам присоединяется лиганд (АцХ или какой–либо егоагонист, например карбахолин или никотин), то канал с высокой вероятностью переходит из закрытого состояния в открытое. Этот воротный процесс лучше всего изучен на мышцах лягушки, в двигательных концевых пластинках которых располагаются АцХ–активируемые каналы (см. рис. 6–18). Как мы уже говорили, постсинаптические каналы двигательной концевой пластинки скелетных мышц лягушки при активации ацетилхолином становятся проницаемыми как для К ⁺ , так и для Na ⁺ . При этом возникает входящий ток, потенциал реверсии для которого составляет около –10 мВ. В норме эти каналы и связанные с ними АцХ–рецепторы располагаются только в постсинаптической мембране концевой пластинки. По оценкам плотность АцХ–активируемых каналов в этой области равна примерно 10⁴/мкм².

 

 

Рис. 6.28. Реконструкция канала ацетилхолинового рецептора (никотинчувствителъного) по данным электронной микроскопии и дифракции рентгеновских лучей. А. Канал, состоящий из пяти субъединиц, пронизывает липидный бислой и возвышается над обеими поверхностями мембраны. Вход в канал представляет собой широкое воронкообразное углубление, постепенно сужающееся и переходящее в конце концов в селективный фильтр. Б. Вид на канал сверху. Изображено пять субъединиц в их предполагаемом взаимном расположении. Особый интерес представляют α–субъединицы, поскольку именно на них локализованы два участка связывания двух молекул АцХ; это связывание и приводит к активации канала. (Из работы Kistler et al, 1982, с изменениями.)

 

 

Если денервировать мышцу, перерезав двигательный нерв, то зона чувствительности к АцХ будет постепенно распространяться от области концевой пластинки и охватит большую часть или даже все мышечное волокно. Значит, рецепторы и каналы, которые в норме сосредоточены лишь вблизи концевой пластинки, каким–то образом появляются во внесинаптических участках. В естественных условиях эти внесинаптические АцХ–рецепторы (т. е. каналы) блокированы, причем блокирование частично связано с мало изученным трофическим влиянием мотонейронов, иннервирующих мышечные клетки, а   частично – с   электрической   и   сократительной активностью таких иннервированных клеток. Если двигательное волокно регенерирует и реиннервирует мышцу, внесинаптические рецепторы исчезают и чувствительность к АцХ вновь начинает проявляться лишь в области синапса (концевой пластинки).

Такое «рассеянное» распределение внесинаптических АцХ–активируемых каналов, проявляющееся после денервации мышцы лягушки, исследовали Эрвин Неер и Берт Сакман (1976), изучавшие воротные процессы. Авторы использовали разработанный ими метод локальной фиксации (см. рис. 5–28. А). Для того чтобы увеличить движущую силу для входящего тока, на мышечном волокне фиксировали гиперполяризующий мембранный потенциал. Микропипетку с оплавленным кончиком (диаметр отверстия 10 мкм²) заполняли раствором Рингера, содержащим АцХ или один из его агонистов (т.е. веществом, оказывающим сходное действие) в низкой концентрации, и подсоединяли ее к высокочувствительному  усилителю  тока,  обладающему низким уровнем шумов (рис. 6–29, А). Когда такую пипетку плотно прижимали к поверхности денервированного мышечного волокна, усилитель регистрировал очень небольшие (менее 5·10^–12 А) кратковременные входящие токи (рис. 6–29, Б). Эти токи возникали в результате временного открывания каналов, активируемых АцХ (или его агонистом).В этом опыте Неер и Сакман впервые в истории записали токи через одиночные каналы в биологической мембране. Это были первые прямые данные о том, что ионные токи текут через мембрану по дискретным каналам с воротными устройствами, а не с помощью каких–либо других механизмов, например при участии молекул–переносчиков.

 

Рас. 6.29. Токи, текущие через одиночный АцХ–активируемый канал. Использовали препарат денервированной мышцы лягушки и метод локальной фиксации. А. Методом фиксации потенциала на мембранном волокне создавали гиперполяризующий потенциал (–120мВ). Микропипетка для локальной фиксации была заполнена раствором Рингера, содержащим агонист АцХ суберилхолин  (2·10–7 М). Б. Запись кратковременных входящих токов, регистрируемых с помощью микропипетки, плотно прижатой к мембране. Токи текут через АцХ–активируемые каналы, отрывающиеся при связывании с рецепторами агониста АцХ. (Neher, Sakmann, 1976.)

 

 

Важная особенность такого рода токов чем одиночные каналы заключается в том, что они имеют вид более или менее прямоугольных импульсов (скачкообразно возникают и прекращаются), т. е. подчиняются закону «все или ничего». Именно так должны вести себя каналы, которые могут находиться лишь в одном из двух состояний – полностью открытом или полностью закрытом. Более того, если электрохимические градиенты не изменяются, то токи через одиночные АцХ–активируемые каналы по величине примерно одинаковы. Следовательно, проводимость всех этих каналов также одинакова. Если в участке под микропипеткой одновременно открываются два или несколько канала, то одиночные токи через каждый из этих канала суммируются и в результате регистрируется ток в два (или три и более) раза превышающий одиночный ток. Частота возникновения таких токов пропорциональна концентрации АцХ или его агониста в растворе, содержащемся в микропипетке; если же эти вещества в растворе отсутствуют, то токи не регистрируются. Из величины одиночного тока была рассчитана проводимость отдельного канала в открытом состоянии; она оказалась равной около 2·10^–11 См, что соответствует сопротивлению 5·10¹⁰ Ом.

После этих первых работ по локальной фиксации, проведенных Неером и Сакманом, появилось множество других исследований, в которых методами регистрации токов через одиночные каналы был детально изучен как АцХ–активируемый канал, так и многие другие хемочувствительные постсинаптические каналы. Статистический анализ одиночных токов показал, что каналы случайным образом изменяют свое состояние (флуктуируют), переходя из нескольких закрытых состояний в по меньшей мере одно открытое. Очевидно, связывание молекулы агониста с рецептором закрытого канала резко увеличивает вероятность его перехода в открытое состояние, когда ионы в течение короткого промежутка времени могут переходить через данный канал. Далее либо канал временно спонтанно переходит в закрытое состояние, либо молекула агониста отсоединяется от рецептора, и канал снова закрывается и находится в этом состоянии до тех пор, пока агонист вновь не свяжется рецептором.

Такого рода синаптическая активация, при которой медиатор увеличивает вероятность перехода постсинаптического канала в открытое состояние, распространена наиболее широко. Мы лишь вкратце отметим, что известно несколько синапсов, в которых медиатор, напротив, снижает вероятность открывания канала. Так, в нейронах морского зайца Aplysia californica медиатор серотонин (5–гидрокситриптамин, 5–ГТ) вызывает закрывание определенных калиевых каналов. Подобного рода снижение ионной проницаемости при синаптической активации было обнаружено и в некоторых нейронах вегетативных ганглиев позвоночных. В то же время такой механизм, очевидно, встречается гораздо реже, чем механизм с увеличением ионной проницаемости. Недавно были получены данные, свидетельствующие о том, что уменьшение проницаемости постсинаптических каналов при связывании медиатора с рецептором обусловлено внутриклеточными переносчиками типа циклического аденозин–3'–5'–монофосфата (сАМР; разд. 9.2.1).