Биосинтез и клеточная локализация ферментов

Биосинтез молекулы фермента происходит в клетке по схеме синтеза белка. Наиболее интенсивно синтезируются ферменты в период роста и развития. В отдельных органах ферменты синтезируются в больших количествах. Например, слюнные, желудочные, кишечные, поджелудочные железы синтезируют ферменты, обеспечивающие гидролитическое расщепление кормовых масс. Для ферментов характерна определенная клеточная локализация. В клеточном ядре находятся ферменты обмена нуклеиновых кислот – ДНК-полимераза, гираза, РНК-полимераза и т.д. В митохондриях – ферменты цикла трикарбоновых кислот и дыхательной цепи, окисления жирных кислот; в цитозоле – ферменты гликолиза, синтеза жирных кислот, активирования аминокислот; в рибосомах – ферменты белкового синтеза; в лизосомах – ферменты, гидролизующие белки, нуклеиновые кислоты, липиды и полисахариды – катепсины, ДНК-азы, РНК-азы, фосфатазы и т.д. При этом ферменты в клетке находятся не в разрозненном состоянии, а функционируют в виде агрегатов сложных, строго упорядоченных структур. Формирование этих структур осуществляется с участием молекулярных шаперонов, то есть временных сопровождающих участников, которые не входят в состав конечных продуктов. Шапероны состоят из 7-членного кольца (бублика), имеют форму колеса и "катятся" по ниточке актина (при сокращении мышечной ткани) или вдоль микротрубочек, транспортируя белковые молекулы к месту назначения. Так, полиферментный пируватдегидрогеназный комплекс состоит из трех ферментов. В состав этого комплекса E.coli, Мм 4,6x10 Да, входят 24 молекулы пируватдегидрогеназы, 24 молекулы дегидролипоилтрансферазы, 12 субединиц дегидролипоилдегидрогеназы и 3 дополнительных белка. Этот комплекс диаметром 300 А осуществляет непрерывный ферментативный процесс окислительного декарбоксилирования и его регуляцию. Гликолиз, если начинается с гликогена, то обеспечивается участием 14 ферментов, находящихся в виде сложного комплекса на мембранах, их называют метаболоном. Метаболон – это надмолекулярный комплекс ферментов, катализирующих последовательные стадии метаболического пути в структурных элементах клетки.

Химическая природа ферментов

Ферменты являются белками. Это доказывается тем, что ферменты брожения инактивируются (Jl. Пастер) при кипячении, при котором происходит необратимая денатурация белка-фермента. Фермент при этом теряет свою способность катализировать химическую реакцию. Точно так же при кипячении белки теряют другие биологические свойства – антигенные, гормональные, каталитические. Ферменты при гидролизе распадаются на аминокислоты.

Многие ферменты выделены в виде индивидуального белка в кристаллической форме, сейчас свыше 200 ферментов выделены в чистом виде и изучена их первичная структура. Первый кристаллический фермент уреаза был получен в 1926 году Самнером. В 1930 г. Нортрап выделил в виде кристаллов пепсин, в 1931 г. – трипсин.

Будучи белками, они обладают амфотерными свойствами – могут существовать в растворе в виде анионов, катионов и амфионов, обладают электрофоретической подвижностью, а в изоэлектрической точке не обнаруживают подвижности; неспособны к диализу через полупроницаемые мембраны, легко осаждаются методом высаливания, ацетоном, этанолом, обладают высокой молекулярной массой (см. таблицу 4.1.).

Таблица 4.1.

Молекулярная масса ферментов

Фермент	М.м.	Фермент	М.м.
Рибонуклеаза Цитохром С Трипсин Пепсин Каталаза Глутаматдегидрогеназа	13700 15000 23000 32000 248000 336000	Гексокиназа Щелочная фосфатаза Лактатдегидрогеназа Альдолаза Уреаза Пируватдегидрогеназа	45000 80000 140000 142000 480000 4500000

Ферменты обладают высокой специфичностью действия. В последние годы показано, что кроме белков ферментативной активностью обладают и молекулы РНК, их называют рибозимы. Каталитической активностью обладают также некоторые антитела, их называют абзимы. Так антитела, образующиеся при аутоиммунных заболеваниях, способны гидролизовать белки, РНК и ДНК. Иммуноглобулины G молока и их фрагменты могут гидролизовать моно-, ди- и трифосфаты.

При работе с ферментами нужно учитывать их белковую природу, чтобы сохранить их стабильность; для этого надо соблюдать:

1. оптимальную температуру ферментативной реакции - для теплокровных животных 37-40 ⁰C, а при выделении и очистке ферментов - 0 ⁰C. Нужно учесть, что некоторые ферменты очень чувствительны к пониженной температуре (АТФаза из митохондрий);

2. рН - в пределах 6,0-8,0 оптимален для большинства ферментов. Хотя имеются ферменты для которых оптимальными являются рН 2,0 (пепсин) и рН 7-10 (трипсин);

3. лиофильная сушка - высушивание в вакууме из замороженного состояния - широко применяется для получения нативных белковых препаратов и их длительного хранения. Примеры: криоконсервирование крови, антигенов, антител -диагностикумов, вирусных, бактериальных препаратов, получение сухого молока и т.д.;

4. осаждение ацетоном и спиртом проводят при низкой температуре, что позволяет сохранять нативность ферментов;

5. для стабилизации ферментов используются часто хелатообразующим веществом ЭДТА - этилендиаминтетраацетатом, который связывает ионы тяжелых металлов (Cu, Pb, Hg и т.д.), тем самым способствует сохранению нативных свойств фермента.