Клонирование животных
Под клоном понимают генетически однородные потомки одной исходной особи, образующиеся в результате бесполого размножения.
Для создания генетических копий сельскохозяйственных животных методом клеточной инженерии разрабатываются способы клонирования: пересадка ядер соматических клеток в яйцеклетку с предварительно удаленным ядром. Для этого берут от донора стволовые (не прошедшие дифференцировку) клетки. Ядро стволовых клеток in vitro вводят в энуклеированные яйцеклетки реципиента. Полученные таким способом зиготы крупного рогатого скота можно культивировать in vitro до 8-, 16-ти даже 32-клеточной стадии. Таких эмбрионов, достигших завершающих стадий предимплантационного развития, можно не только трансплантировать коровам-реципиентам или замораживать для длительного хранения, но использовать для последующего клонирования. Таким образом, можно в условиях in vitro получать неограниченное количество эмбрионов. Метод клонирования животных является очень привлекательным для получения неограниченно большого количества копий от высокопродуктивных особей, а потому разрабатывается очень интенсивно.
Достижения молекулярной биологии по изучению роли нуклеиновых кислот в процессах жизнедеятельности привели к разработке совершенно новых методов диагностики болезней животных и человека на основе уникальных свойств ДНК и РНК. Это – методы молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции.
Метод молекулярной гибридизации
Метод молекулярной гибридизации (ДНК-гибридизация, ДНК-зонды) широко применяется для диагностики инфекционных болезней, в генетике, криминалистике и т.д. Метод основан на уникальном свойстве генетического материала организма – молекулы ДНК –, состоящей из мононуклеотидов, образовывать двойную спираль с комплементарно соединенными азотистыми основаниями. Известно, что молекула ДНК представляет полимер, состоящий из четырех видов дезоксирибонуклеотидов (dAMP, dGMP, dTMP, dCMP), соединенных между собой 3'- и 5'-фосфодиэфирными связями дезоксирибоз. Молекула ДНК образует двойную спираль, при которой азотистые основания первой цепи строго комплементарно соединяются водородными связями с азотистыми основаниями второй цепи, при этом аденин соединяется с тимином, гуанин с цитозином.
Принцип метода
Структуру двойной спирали ДНК (или РНК), скрепленную водородными связями, можно разрушить нагреванием, поскольку спаренные, не связанные между собой ковалентно, две полинуклеотидные цепи ДНК после разрыва всех водородных связей полностью разделяются.
Процесс разделения цепей называют денатурацией или плавлением ДНК. Денатурация происходит в узком интервале температур и сопровождается гиперхромным эффектом, т.е. при этом происходит возрастание поглощения ультрафиолетовых лучей. Температуру, при которой происходит разделение цепей ДНК, называют точкой плавления (Т пл.), которая в зависимости от состава ДНК имеет величину примерно 85-95о C. Процесс денатурации ДНК обратимый, т.е. при снижении температуры происходит восстановление водородных связей – отжиг – образование двойной спирали. Это явление называют ренатурацией (рис. 12.2.). Ренатурация связана со специфичностью спаривания азотистых оснований между комплементарными цепями. Реакция происходит в две стадии: вначале короткие комплементарные последовательности двух цепей случайно соединяются друг с другом и образуют двухспиральный участок, затем образуется длинная двухцепочечная структура с восстановлением первоначальных свойств, утраченных при денатурации.
В ренатурации участвуют две комплементарные последовательности. Если при этом взяты цепочки молекулы ДНК из различных источников, то говорят о гибридизации, например при отжиге ДНК и РНК.
В основе гибридизации лежит тот же принцип спаривания комплементарных оснований, который обеспечивает репликацию ДНК или ренатурацию молекул. Способность к гибридизации двух препаратов нуклеиновых кислот является строгим тестом на комплементарность их последовательностей.
Рис. 12.2. Схема денатурации и ренатурации ДНК; двойная спираль образуется по принципу комплементарности азотистых оснований.
а) нативная молекула ДНК,
б) денатурированная молекула ДНК,
в) ренатурированная молекула ДНК.