- •Биохимия животных Электронный дидактический комплекс (эдк)
- •Физическая химия вода
- •Активная реакция водных растворов
- •Ионное произведение воды. Водородный показатель
- •Методы определения рН среды
- •Роль активной реакции среды в биологических процессах
- •Буферные pacтворы, состав, механизм действия
- •Буферная емкость
- •Биологическое значение буферных систем
- •Коллоидная химия
- •Классификация дисперсных систем
- •Поверхностные явления
- •Адсорбция
- •Коллоидные растворы (золи) Методы получения
- •Строение коллоидных частиц
- •Коагуляция. Седиментация. Пептизация
- •Молекулярно-кинетические свойства коллоидных растворов
- •Осмотическое давление
- •Биологическое значение явления осмоса
- •Механизмы, участвующие в сохранении изоосмии:
- •Оптические свойства коллоидных систем
- •Растворы высокомолекулярных соединений
- •Свободная и связанная вода в коллоидных pacтвopax
- •Свойства растворов вмс
- •Денатурация
- •2. Белки; биологическая роль Аминокислоты
- •Содержание белков в организме и тканях
- •Методы выделения белков
- •Методы фракционирования и очистки белков
- •Физико-химические свойства белков
- •Аминокислоты
- •Ациклические аминокислоты
- •Структура белковой молекулы
- •Классификация белков
- •Химия сложных белков
- •3. Нуклеиновые кислоты
- •Нуклеотиды и нуклеозиды
- •Структура днк
- •Рибонуклеиновые кислоты
- •4. Ферменты
- •Биосинтез и клеточная локализация ферментов
- •Химическая природа ферментов
- •Строение ферментов
- •Активный центр фермента
- •Регуляция активности ферментов
- •Механизм действия ферментов
- •Основные свойства ферментов
- •2. Зависимость активности ферментов от рН среды.
- •Факторы, определяющие активность ферментов
- •Активирование и ингибирование ферментов
- •Типы ингибирования
- •Классификация и номенклатура ферментов
- •Применение ферментов.
- •Использование иммобилизованных ферментов для производства биологических соединений
- •Иммуноферментный анализ и его использование в ветеринарии
- •5. Химия витаминов
- •Классификация и номенклатура витаминов
- •I. Жирорастворимые витамины
- •II. Витамины, растворимые в воде
- •Витамин d, антирахитический, кальциферол
- •Витамин e, антистерильный, токоферолы
- •Витамин к, антигеморрагический (филлохинон)
- •Витамин q (убихинон)
- •Водорастворимые витамины
- •Витамин b1, антиневритный, тиамин
- •Витамин b2, рибофлавин
- •Витамин b3, пантотеновая кислота
- •Витамин b5, pp, никотинамид, ниацин, антипеллагрический
- •Витамин b6, адермин, пиридоксол
- •Витамин b12, кобаламин, антианемический
- •Фолиевая кислота
- •Витамин с (аскорбиновая кислота)
- •Биотин, витамин h
- •6. Гормоны
- •Гормоны гипофиза
- •Поджелудочная железа
- •Гормоны щитовидной железы
- •Гормоны надпочечников
- •Гормоны коры надпочечников
- •Гормоны половых желез
- •Гормоны тимуса (вилочковой железы)
- •Гормоны местного действия
- •7. Обмен веществ и энергии
- •Основные этапы обмена веществ
- •Биологическое окисление
- •Окислительное фосфорилирование
- •Токсичность кислорода
- •8. Химия и обмен углеводов
- •Моносахариды
- •Производные моносахаридов.
- •Полисахариды (гликаны)
- •Гетерополисахариды (гетерогликаны)
- •Обмен углеводов
- •Катаболизм глюкозы
- •Гликогенолиз
- •Биосинтез углеводов
- •Биосинтез гликогена (гликогенез)
- •Регуляция углеводного обмена.
- •9. Химия и обмен липидов
- •Химическое строение нейтральных жиров
- •Жирные кислоты.
- •Нейтральные гликолипиды
- •Фосфолипиды (фосфатиды)
- •Сфинголипиды
- •Двойной липидный слой мембран
- •Обмен липидов
- •Переваривание липидов в желудочно-кишечном тракте
- •Промежуточный обмен липидов
- •Энергетический баланс β-окисления жирных кислот
- •Метаболизм ацетил-коэнзима а
- •Пути образования кетоновых тел
- •Биосинтез липидов
- •Метаболизм стеринов и стеридов
- •Липосомы
- •10. Обмен белков
- •Биологическая ценность белков
- •Нормы белка в питании животных
- •Белковые резервы организма
- •Обмен простых белков
- •Переваривание белков в желудочно-кишечном тракте моногастричных животных
- •Переваривание белков в кишечнике.
- •Особенности переваривания белков у жвачных животных
- •Дезаминирование аминокислот
- •Трансаминирование – непрямой путь дезаминирования аминокислот
- •Декарбоксилирование аминокислот
- •Окислительное расщепление аминокислот
- •Особенности обмена отдельных аминокислот
- •11. Биосинтез белка
- •Генетический код
- •Этапы синтеза белка
- •Мультиферментный механизм синтеза белка
- •12.Обмен нуклеиновых кислот Переваривание нуклеиновых кислот в желудочно-кишечном тракте
- •Промежуточный обмен нуклеиновых кислот Распад нуклеиновых кислот в тканях
- •Пиримидиновые основания
- •Биосинтез нуклеиновых кислот
- •Рекомбинантные молекулы и проблемы генной инженерии
- •Клонирование животных
- •Метод молекулярной гибридизации
- •Принцип метода
- •Способы гибридизации
- •Метод блоттинга по Саузерну
- •Полимеразная цепная реакция (пцр)
- •Необходимые приборы и реактивы
- •13. Обмен воды и солей
- •Вода, ее содержание и роль в организме
- •Потребность животного организма в минеральных веществах, их поступление и выделение
- •Микроэлементы
- •14. Биохимия крови
- •Физико-химические свойства крови
- •Буферные системы крови
- •Плазма крови и ее химический состав
- •Белки плазмы и сыворотки крови
- •Небелковые азотистые вещества крови
- •Форменные элементы крови
- •15. Биохимия мышечной ткани
- •Механизм сокращения мышцы
- •Азотистые экстрактивные вещества мышц
- •Минеральные вещества
- •Окоченение мышц
- •16. Биохимия молока и молокообразования
- •17. Биохимия почек и мочи
- •Патологические компоненты мочи
- •Особенности мочи птиц
- •18. Биохимия кожи и шерсти
- •19. Биохимия яйца
- •Биосинтез компонентов яйца
- •Предметный указатель
- •Приложения
- •Рекомендуемая литература
- •Тесты для проверки биохимических
- •Глава 8. Химия обмена углеводов
- •24. Сложноэфирные связи в молекулах триацилглицеролов подвергаются ферментативному гидролизу при участии:
- •Глава 11. Синтез белка
- •Глава 12. Обмен нуклеиновых кислот
- •Глава 13. Биохимия почек и мочи
Способы гибридизации
Гибридизацию можно осуществлять в растворе или на фильтре (капроновом или нитроцеллюлозном). При гибридизации молекул в растворе препараты (одноцепочечные молекулы) смешивают и определяют образование двухцепочечных молекул при отжиге по изменению гиперхромного эффекта или же по количеству метки в двухцепочечной ДНК (для этого один из препаратов ДНК предварительно метят радиоактивным изотопом). Удобным для работы является метод гибридизации с использованием фильтров. При этом один из препаратов ДНК иммобилизуют на нитроцеллюлозных фильтрах, на которых молекула ДНК адсорбируется. Фильтры с адсорбированной одноцепочечной ДНК обрабатывают таким образом, чтобы предотвратить дальнейшую адсорбцию одноцепочечных молекул.
На рис. 12.3. показана схема гибридизации на фильтре.
Рис. 12.3. Схема гибридизации на фильтре.
А - иммобилизованная на фильтре одноцепочечная ДНК;
Б - одноцепочечная ДНК в растворе;
В - фильтр с иммобилизованной одноцепочечной ДНК опускается в раствор, содержащий денатурированную молекулу ДНК.
Фильтр с адсорбированной ДНК погружают в раствор, содержащий второй препарат денатурированной ДНК (ДНК-зонд). Связывание ДНК-зонда происходит только в том случае, если он имеет комплементарную последовательность с первоначально адсорбированной на фильтре молекулой ДНК.
Эффективность гибридизации определяют по количеству метки, оставшейся на фильтре. Метод является очень чувствительным и применяется для изучения структуры гена. При этом необходимо иметь меченые радиоактивным изотопом РНК или ДНК-зонды, идентификация которых с исследуемой молекулой регистрируется с помощью радиоавтографии. В качестве зонда используют клонированную кДНК-копию, т.е. меченую радиоактивным изотопом молекулу ДНК с известной последовательностью нуклеотидов.
Метод блоттинга по Саузерну
Для идентификации гена молекулу ДНК генома расщепляют с помощью ферментов рестриктаз на куски размером примерно по 15-20 тысяч пар нуклеотидов. Расщепленный таким образом геном подвергается электрофоретическому фракционированию в агарозном геле. После этого фракции ДНК денатурируют нагреванием и переносят из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр, где их иммобилизуют. Процесс переноса ДНК напоминает промокание (по английский – блоттинг) и называется методом блоттинга по Саузерну. Сущность блоттинга заключается в том, что агарозный гель помещают на фильтровальную бумагу, смоченную в концентрированном солевом растворе; затем на гель накладывают нитроцеллюлозный фильтр и сверху помещают сухую фильтровальную бумагу. Солевой раствор впитывается в сухую бумагу; чтобы это произошло, он должен пройти сквозь агарозный гель и затем через нитроцеллюлозный фильтр. ДНК переносится вместе с раствором, но задерживается нитроцеллюлозой. Иммобилизованную таким образом ДНК можно гибридизовать на месте с радиоактивным зондом. Со специфическим зондом будут гибридизироваться только комплементарные ему фрагменты. Так как зонд радиоактивный, то гибридизацию можно обнаружить с помощью авторадиографии. Каждая комплементарная последовательность проявляется в виде радиоактивной полосы, местоположение которой определяется размером фрагмента ДНК. Схема метода блоттинга по Саузерну представлена на рис. 12.4.
Рис. 12.4. Схема блоттинга по Саузерну: расщепление ДНК генома с помощью рестриктаз на куски 15000-20000 пар нуклеотидов; электрофоретическое разделение этих рестриктаз в агарозном геле, перенос их на нитроцеллюлозный фильтр, гибридизация с ДНК-зондом и выявление образующихся гибридных молекул методом авторадиографии; *)схема переноса (блоттинга).
Метод блоттинга является высокочувствительным и точным и широко применяется в криминалистике, медицине, ветеринарии. В настоящее время метод молекулярной гибридизации разработан для диагностики инфекционных болезней сельскохозяйственных животных, например для обнаружения возбудителя сибирской язвы, бруцеллеза, туберкулеза, ящура, чумы свиней, чумы птиц, энтеровирусов и т.д. Этот метод является» перспективным для изучения племенных качеств животных. Он имеет преимущества перед принятым сегодня в селекции методом изучения маркеров белкового полиморфизма.
Считают, что метод ДНК-гибридизации может успешно использоваться в селекции быков, так как геном быков можно разделить на гены, которые в дальнейшем выявляются блоттингом. При этом необходимо выделить около 75 фрагментов ДНК, чтобы оценить геном по признаку молочной продуктивности.
В последние годы разрабатывается новый метод анализа ДНК, так называемая "геномная дактилоскопия". Геномная дактилоскопия включает следующие этапы: выделение ДНК, фрагментации ее с помощью ферментов - рестриктаз, фракционирование с помощью электрофореза в геле. Фрагменты ДНК, содержащие гипервариабельные участки, выявляют с помощью специального зонда – "пробы Джеффриса", с которой они связываются путем гибридизации. Участки гибридизации выявляются путем авторадиографии.
Исследования показали, что в этой методике в качестве радиоактивного зонда может быть использована ДНК, выделенная из бактериофага Ml3. ДНК этого бактериофага содержит еще один тип гипервариабельной последовательности, который найден также и в геноме человека. Принцип строения этой гипервариабельной последовательности в общих чертах сходен со строением минисателлитной ДНК Джеффриса. Использование этой новой пробы для генной "дактилоскопии" показало ее высокую эффективность и пригодность для решения многих задач. Дело в том, что эти гипервариабельные последовательности обнаружены у разных представителей живой природы – человека, животных, растений и бактерий, а потому ДНК-зонд бактериофага M13 может быть использован в широких масштабах. Например, для идентификации личности, для установления родства любых живых существ. Метод дает возможность решать вопросы генетики и селекции животных, вести отбор по полезным признакам; используя этот метод можно вести генную паспортизацию отдельных высокопродуктивных животных, анализировать родословную и полученные сведения использовать для направленной селекции.
Существует еще одна разновидность гибридизационного анализа ДНК – это метод точечной (дот) гибридизации (рис.9), который выполняется путем внесения исследуемых образцов ДНК в денатурированном состоянии на капроновые мембранные фильтры в виде точек. Например (рис. 12.5), ДНК микобактерий туберкулеза крупного рогатого скота в количестве 3 мкл (1,8 мкг/мл) в виде точек наносится в квадраты (1,5 х 1,5 см).
Рис. 12.5. Дот-гибридизация ДНК-зонда M.bovis: А: 1 - M.bovis: 2,3, - ДНК из пораженной туберкулезом ткани; В: 1,2,3 - ДНК, выделенная из тканей здоровых животных; С: 1 - ДНК возбудителя бруцеллеза ;
2 - ДНК возбудителя листерий;
3 - ДНК M. fortuitum.
Одноцепочечные молекулы ДНК (денатурированные) адсорбируются на мембране и фиксируются. После этого на фильтр наносится ДНК-зонд, меченный радиоактивным фосфором, то есть одноцепочечная молекула M.bovis, меченая P32 . Поскольку в данном случае азотистые основания молекул ДНК M.bovis и меченого P32 ДНК-зонда комплементарны, то происходит связывание азотистых оснований нитей ДНК и ДНК-зонда с образованием двойной спирали. После этого несвязанные молекулы ДНК-зонда отмываются и образующиеся гибридные молекулы выявляются путем радиоавтографии.