РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ШТАММОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

3.Перемешать содержимое с помощью вортекса, сбросить его на дно пробирок кратковременным центрифугированием.

4.Ввести в память амплификатора программу амплификации для данной смеси:

1)95 °С – 3 мин,

2)94 °С – 1 мин,

3)55 °С – 1 мин,

4)72 °С – 1 мин 30 с.

5.Повторить шаги 2–4 в течение 30 циклов.

5)72 °С – 10 мин

6)4 °С – 5 мин

6.Поставить пробирки в нагретый до 95 °С блок амплификатора, закрыть термоблок крышкой. Запустить программу амплификации.

7.По окончании амплификации проанализировать размер и количество полученных ампликонов электрофорезом в 1 %-м геле агарозы (наносить 1/10 часть реакции). В одну из лунок обязательно нанести отрицательный контроль амплификации! Если в нем обнаружена амплифицированная ДНК, это свидетельствует о контаминации ПЦР-смеси в процессе сборки либо о наличии ДНК-контаминации компонентов набора для ПЦР. Контаминированные ампликоны анализируемых образцов не могут быть использованы для секвенирования.

8.Если в отрицательном контроле нет следов контаминации, ПЦРпродукты исследуемого образца перед секвенированием необходимо очистить от примеси ДНК-полимеразы экстрагированием смесью фенола и хлороформа 1:1, а затем осадить ДНК из раствора этанолом.

9.Для секвенирования используют те же праймеры, что и для ПЦР, и ПЦР-продукты в количестве 250–500 нг на каждые 1000 пар нуклеотидов.

Задание 1.6.3. Проведение секвенирования

Процедура секвенирования подробно описана в работе 1.5 «Определение нуклеотидной последовательности на секвенаторе ALFexpress II DNA».

РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ШТАММОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

Задание 1.6.4. Анализ полученных данных

Порядок выполнения работы

1.По окончании процедуры секвенирования полученные данные обрабатываются в программе ALFwin Sequence Analyzer 2.11. (поставляется в комплекте программ автоматического секвенатора).

2.Нуклеотидные последовательности фрагментов гена 16S рРНК сравниваются с последовательностями баз данных Интернета GenBank

[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/] или EMBL [http://www.ebi.ac.uk/fasta33/nucleotide.html] в режиме on-line с помощью программы BLAST или FASTA. Результатом работы программ является список нуклеотидных последовательностей, близкородственных анализируемой.

3.Для дальнейшего сравнительного анализа изучаемая нуклеотидная последовательность должна быть выровнена (английский термин «aligned»)

снесколькими гомологичными последовательностями генов 16S рРНК из баз данных с помощью программы ClustalW [on-line-версия http://www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html]. Построение филогенетических де-

ревьев, основанных на сравнении генов 16S рРНК, производится с помощью neighbor-joining-метода, реализованного в пакете программ TREECON [бесплатная версия на официальном сайте http://biocwww.uia.ac.be/u/yvdp/treeconw.html].

Контрольные вопросы

1.Какие из молекул, содержащихся клетке, могут повлиять на выделение ДНК?

2.На каких принципах основан метод ПЦР?

3.Зачем нужны праймеры и как выбрать их последовательность?

4.Какие экспериментальные условия необходимо соблюдать при постановке ПЦР? С чем это связано?

5.Что такое Tаg-полимераза? Что должно находиться в реакционной смеси для ее эффективной работы?

6.Как происходит разделение ДНК-фрагментов во время электрофоре-

за?