РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ

рами инфекции. Кроме того, эти болезни обладают способностью быстро распространяться. В результате сорт постепенно теряет свою первоначальную продуктивность и вырождается.

Продление жизни и длительное сохранение репродуктивных качеств сорта достигаются за счет хорошо налаженного семеноводства или поддерживающей селекции, суть которой сводится к сохранению репродуктивных качеств сорта в системе элитного семеноводства, а также ежегодном производстве элиты в необходимом объеме. Качество этой элиты обеспечивается проведением семеноводства на безвирусной основе с применением биотехнологических методов. Их регулярное применение обеспечивает повышение урожайности картофеля в 2 раза.

Задания на выполнение лабораторной работы

Задание 4.3.1. Выделение и культивирование апикальных меристем картофеля

Культура изолированных апикальных меристем используется для получения свободного от вирусов посадочного материала и для его микроклонального размножения. Апикальная меристема обычно совершенно свободная от вирусов представляет собой конус активно делящихся клеток высотой 0,1 мм (100 мк) и шириной 0,25мм. Это минимальный размер меристемы, при котором морфогенетическая способность еще сохраняется. Поскольку меристему бывает трудно вычленить без повреждений, часто ее отделяют с двумя листовыми примордиями (апексы размером 100–250 мкм, рис. 4.1). Для повышения эффективности оздоровления картофеля применяют сочетание метода верхушечной меристемы с термоили химиотерапией. Тепловая обработка вызывает инактивацию вирусов, химические вещества ингибируют их развитие. Выращенные из апикальных меристем безвирусные растения могут быть размножены и высажены в теплицы для получения безвиру с- ных клубней. Для ускоренного размножения оздоровленного материала используются также клубни, образовавшиеся на безвирусных растениях в пробирках.

Материалы и оборудование

1.Клубни картофеля.

2.Бинокулярная лупа.

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ

3.Скальпели (или лезвия), зажатые в держателе с удлиненной ручкой.

4.Препаровальные иглы.

5.Пенициллиновые флаконы со стерильной питательной средой MS, содержащей кинетин (0,5 мг/л), активированный уголь и др.

6.Стаканы со стерильной дистиллированной водой.

7.Чашки Петри, скальпели, пинцеты.

Порядок выполнения работы

Подготовка ростков клубней для вычленения меристем заключается в их проверке на исходную зараженность вирусами, поверхностном обеззараживании от грибных и бактериальных инфекций. Клубни картофеля хранят при температуре 4–6 °С, затем проращивают на свету до образования ростков 2–3 см длины при 20–22 °С.

1.Клубень картофеля промыть в проточной воде, отделить ростки.

2.Ростки упаковать в марлевые салфетки, опустить в раствор 0,1 %-го диацида на 3–5 мин, затем не менее трех раз промыть стерильной водой, опустить в стерильную чашку Петри, добавив туда воды для предотвращения высыхания эксплантов. Работы по вычленению проводят в ламинар-боксе.

3.Перед вычленением с помощью препаровальной иглы под бинокулярным микроскопом с верхушки ростка удалить покровные листочки, последовательно обнажая боковые и верхушечные меристемы с примордиальными листочками.

4.Меристему (рис. 4.2), включающую кусочек ткани размером 100–250 мк без листовых зачатков (примордиев), вычленить иглой, зажатой в цанговый держатель. Для этого можно использовать и специальную заточенную дисцизионную (разовую иглу от шприца) иглу или кусочек лезвия, зажатый в цанговый держатель. Эту операцию лучше проводить под бинокулярным микроскопом с 24-кратным увеличением с масштабной сеткой. Вычленить можно как верхушечную, так и боковые меристемы – точки роста. Каждую операцию проводят отдельным простерилизованным инструментом.

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ

5.После вычленения меристему на острие иглы перенести на поверхность питательной среды в пробирку или пенициллиновый флакон, и закрыть ее фольгой.

6.Штативы с пробирками или поднос с флаконами поместить в световую комнату.

7.Дальнейшее культивирование проводить в световой комнате на стеллажах.

Рис. 4.2. Этапы развития апикальной меристемы картофеля на питательной среде, содержащей активированный уголь: а – меристема после ведения в культуру; б – начало развития адвентивных почек; в – формирование адвентивных побегов (фото Н.В. Зобовой)

Обработка полученных результатов

1.Каждая проба (пробирка) должна быть зафиксирована после введения экспланта в культуру, а затем при проведении наблюдений и пассажах на свежие питательные среды должны быть отражены все изменения. Оформить таблицу 4.2 и заполнить ее после окончания манипуляций в ламинарбоксе (первые 4 графы). Количество строк соответствует введенным в культуру эксплантам.

2.В табл. 4.2 после учета характеристик (заражение, нарастание каллусной ткани или появление органогенеза) в процессе последующего их наблюдения внести изменения в остальные две графы.

Втечение периода регенерации (морфогенетический ответ на стимул, который приводит к образованию органов, зародышей или целых растений) разросшуюся ткань меристемы пересаживают на новую порцию той же сре-

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ

ды для дальнейшего развития адвентивных почек. Образовавшиеся проростки пересаживают на новую по составу среду. Растения-регенеранты, содержащие до 5 междоузлий, используют для черенкования (Задание 4.3.2).

Задание 4.3.2.Микроразмножение картофеля черенкованием побегов

Клональное размножение оздоровленного картофеля решает вторую не менее важную задачу – получение оздоровленного исходного материала в количествах, достаточных для включения его в семеноводческую работу. Одним из наиболее распространенных способов ускоренного размножения картофеля является черенкование в пробирочной культуре. Главное требование к питательной среде – обеспечение высокого коэффициента размножения, то есть максимального выхода растений из микрочеренков в минимальные сроки.

Этому требованию в наибольшей степени отвечает среда с минеральной основой по Мурасиге-Скуга с добавлением кинетина (0,04 мг/л), ИУК (1,0 мг/л) и феруловой кислоты (0,02 мг/л). Суть метода сводится к следующему. Растение извлекают пинцетом из пробирки и разрезают на микрочеренки, содержащие участок стебля 1–1,5 см с одним междоузлием (рис. 4.3, а). Черенки высаживаются на питательную среду (рис. 4.3, б). Размножение основано на подавлении апикального доминирования (подавление роста боковых почек растительного побега или наличие терминальной почки) и активации путем удаления верхушечного побега пазушных меристем, из которых при помещении на питательную среду развивается побег (рис. 4.3, в).

Растения-регенеранты, полученные в культуре тканей, должны быть подвергнуты анализу на наличие вирусной инфекции. Контроль растенийрегенерантов проводят с помощью нескольких методов.

Электронно-микроскопический анализ основан на визуальном выявлении вирусов. Для приготовления препаратов при первом и последующих черенкованиях из нижней части растения отбирают один черенок с хорошо развитым листом, чтобы получить достоверные результаты, необходимо при последовательных черенкованиях провести трехкратную диагностику по 2–4 препарата каждый раз.

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ

Рис. 4.3. Этапы размножения пробирочных растений картофеля черенкованием: а

– микропобег – объект черенкования (линиями отмечены места разрезов при черенковании); б – микрочеренок на питательной среде; в – развитие растения картофеля из черенка (фото Н.В. Зобовой)

Биологический метод основан на определении инфекционных свойств вирусов с помощью растений-индикаторов, реагирующих определенными симптомами на тот или иной вирус.

Хорошие результаты дает использование для контроля зараженности растений наборов для твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА), основанного на использовании антител, меченных ферментом. За рубежом этот метод известен как ЭЛИЗА-тест. В качестве фермента обычно используют щелочную фосфатазу с субстратом – n-нитрофенилфосфатом, а также пероксидазу хрена с 5-аминосалициловой кислотой или ортофенилдиамином в качестве субстратов.

Материалы и оборудование

1. Пробирочные растения картофеля (сформированные в результате выполнения задачи 4.3.1).

2.Пробирки с модифицированной питательной стерильной средой MS

сдобавлением кинетина – 0,04 мг/л, ИУК – 1,0 мг/л.

3.Стерильные скальпели и чашки Петри.

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ

Порядок выполнения работы

1.Выросшие в пробирках растения картофеля с 5-6-ью листочками перенести из световой комнаты в бокс.

2.Пробирочное растение картофеля вынуть пинцетом из пробирки и поместить его в чашку Петри, разрезать на части (отрезок стебля с листом и пазушной почкой); часть стебля над листом при этом должна быть в 2 –3 раза меньше, чем часть ниже листа. Необходимо соблюдать строгую стерильность.

3.Черенки перенести на свежую питательную среду в пробирки, заглубив нижнюю часть стебля в среду.

4.Закрыть пробирки фольгой, поставить в штатив и перенести в световую комнату.

Черенкование проводят с интервалом в 14–21 день.

Контрольные вопросы

1.Зачем в питательную среду при культивировании картофеля добавляется активированный уголь?

2.Проанализировать полученные результаты культивирования меристем и сделать выводы.

3.Какие условия лучше использовать для проведения дальнейшего микроразмножения картофеля?

4.Сколько черенков можно получить из клубней одного растения картофеля за 3 месяца?

5.С помощью каких процедур увеличивается эффективность оздоровления растений в культуре апикальных меристем?

6.Какие способы микроразмножения растений используют при получении безвирусного посадочного материала картофеля?