РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ

Ширина спектральной линии 5нм.

Оптическая система: расщепленный луч, решетка, двойной детектор. Источник света, время работы лампы: ксенон; 5 лет работы.

Длины волн: диапазон 190 – 1100 нм; точность ±1,0 нм; повторяемость

±0,25нм.

Фотометрия: диапазон 0.3 – 125 %Е, -0,1 – 3.0 А, 0 – 9999 С; снятие показаний: поглощение, пропускание, концентрация; точность: 0,5 % в диапазоне до 2А или 0,005А далее.

Рис. 7.3. Спектрофотометр Genesis 10UV (Thermo Scientific, США)

Задания на выполнение лабораторной работы

Задание 7.1.1. Приготовление образцов для исследования.

Порядок выполнения работы

1)Взять большой зеленый лист растения, разделив его на 3 части площадью по 2–3 см2. Это объекты исследования: первый образец оставить в целом виде, из второго нужно приготовить водный гомогенат, из третьего – спиртовой или ацетоновый экстракт.

2)Приготовить водный гомогенат: разтереть кусок листа в ступке, добавить несколько миллилитров воды, тщательно перемешайть; полученный гомогенат профильтровать через два слоя марли в воронке; разбавить полученный раствор водой, чтобы он стал прозрачным.

3)Приготовить ацетоновый (или спиртовой) экстракт: ножницами измельчить кусок листа и поместить в ступку, добавить около 4 мл 80 %-го аце-

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ

тона (или этилового спирта) и тщательно разотрите содержимое, полученный экстракт профильтровать на воронке через бумажный фильтр, разбавить до получения прозрачного зеленого раствора.

Задание 7.1.2. Измерение спектровпоглощения пигментов растений в составе листа, в водном гомогенате, в ацетоновом экстракте.

Порядок выполнения работы

1) Поместить первый образец – часть целого листа – вдоль прозрачной стенки измерительной кюветы, измерить спектр поглощения данного образца.

Условия измерения: диапазон 400–750 нм, шаг 2 нм (medium), кювета сравнения пустая (воздух).

2)Налить в измерительную кювету 2 мл водного гомогената и измерить спектр поглощения данного образца при аналогичных пункту А условиях (что поместить в кювету сравнения, следует решить самостоятельно).

3)Налить в измерительную кювету 2 мл ацетонового (спиртового) экстракта и измерить спектр поглощения данного образца при аналогичных пункту А условиях (что поместить в кювету сравнения следует решить самостоятельно).

Задание 7.1.3. Проверка выполнения закона Бугера-Ламберта- Бера.

Порядок выполнения работы

1.Разбавить ацетоновый экстракт в 2 раза (это можно сделать, забрав из измерительной кюветы 1 мл экстракта и добавив туда 1 мл растворителя).

2.Измерить спектр поглощения данного образца при аналогичных пункту a) условиях (что поместить в кювету сравнения, следует решить самостоятельно).

3.Повторив данную процедуру еще 4 раза, измерить спектры поглощения экстракта, разведенного в 4, 8, 16 и 32 раза.

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ

Задание 7.1.4. Определение концентрации хлорофиллов«а» и «б» в экстрактах из зеленых листьев.

Порядок выполнения работы

1.Выбрать из спектров, измеренных в задании 2, любой один, оптическая плотность которого в красной области не превышает 1.

2.Используя свойство аддитивности оптических плотностей при длинах

волн 649 нм и 665 нм (соответствующих λмакс для хлорофилла «б» и хлорофилла «а») и табличные значения ε, можно выразить концентрации хлорофиллов следующим образом:

СХлА =11,63 D665 −2,39 D649 ,

СХлБ = 20,11 D649 −5,18 D665 .

3.Подставив в уравнения значения D665 и D649 из выбранного спектра, найти величины концентраций хлорофиллов «а» и «б» (мг/л) в данном разведении.

4.Исходя из получившихся значений, рассчитать концентрацию хлорофиллов во всех других разведениях, полученных в задании 7.1.2.

Составление отчета

1.Спектры поглощения листа и водного гомогената (на одной диаграмме) и всех разведений ацетонового экстракта (на второй диаграмме).

2.Диаграмма, отражающая зависимость D665(СХлА) и D649(СХлБ) по р е- зультатам заданий 2 и 3.

3.Анализ спектров в виде табл. 7.2.

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ

При написании выводов следуетобратить вниманиена следующие вопросы:

•Схожи ли абсорбционные свойства пигментов растений в целом лис-

те, водном гомогенате и ацетоновом экстракте (по λmax)? Что можно сказать о микроокружении пигментов в этих трех системах?

•На каком диапазоне концентраций хлорофиллов выполняется закон Бугера-Ламберта-Бера? Причины нарушения.

•Каково соотношение концентраций хлорофиллов «а» и «б» у высших растений? Выполняется ли это соотношение для экстракта из данного растения?

Контрольные вопросы

1.Что такое оптическая плотность, пропускание, спектр поглощения? Как спектрофотометр получает эти характеристики?

2.Какие эффекты влияют на спектры поглощения макромолекул?

3.Зависимость между какими характеристиками образца отражена в законе Бугера-Ламберта-Бера? При каких условиях этот закон нарушается?

4.Какие задачи решают с помощью методов абсорбционной спектро-

скопии?

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА7.2. АБСОРБЦИОННАЯСПЕКТРОСКОПИЯБЕЛКОВ

Цель лабораторной работы

•изучение закономерности формирования спектров поглощения биологических макромолекул на примере белков.

Краткие теоретические сведения

Представление об основах метода абсорбционной спектроскопии в целом следует получить, изучив теоретические сведения к работе 7.1.

Абсорбционные свойства биологических макромолекул, таких как белки и ДНК, определяются их первичной, вторичной, третичной и четвертичной структурами (что это такое, можно вспомнить, используя литературные источники). Термин нативная структура означает либо структуру макромолекулы, как она существует в природе, либо структуру макромолекулы, когда она выделена, при условии сохранения ферментной активности. Денатурированная структура — такая форма молекулы, в которой по сравнению с нативной изменена пространственная структура. Для белков это обычно означает неупорядоченный (или почти неупорядоченный) клубок. Для двухцепочечной (нативной) ДНК этот термин означает одноцепочечпую ДНК, которая может содержать или не содержать внутрицепочечные водородные связи и которая может неупорядоченно (статистически) агрегировать с одной или несколькими различными единичными цепями (тяжами). Если молекула частично утрачивает нативную структуру, то такую молекулу называют частично денатурированной. Переход от упорядоченной к неупорядоченной структуре ДНК часто называют переходом спираль-клубок, хотя столь же часто применяется термин «денатурация». Обычно переход спираль-клубок происходит при нагревании, при изменении рН и концентрации солей, а также под действием химических денатурирующих агентов. Температуру, при которой переход происходит на 50 %, называют температурой плавления (Тпл) или температурой перехода. Переходы спираль-клубок часто изучают, поскольку из условий перехода можно получить ценную информацию о силах, стабилизирующих структуру макромолекулы.

В результате исследований большого числа биологически важных соединений и макромолекул собран ряд эмпирических фактов, которые могут быть названы рабочими правилами абсорбционной спектроскопии макромолекул:

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.2. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БЕЛКОВ

1. Если аминокислоты: триптофан, тирозин, фенилаланин и гистидин перемещаются в менее полярное окружение, λмакс и ε возрастают.

Следовательно:

а) если в снятом в полярном растворителе спектре аминокислоты, находящейся в составе белка, наблюдаются большие λмакс и ε, чем эти же величины для свободной аминокислоты в том же растворителе, то эта аминокислота находится во внутренней области белка («спрятана») и окружена неполярными аминокислотами;

б) если спектр белка чувствителен к изменению полярности растворителя, аминокислота, для которой наблюдаются изменения λмакс и ε, должна располагаться на поверхности белка.

2. В случае аминокислот λмакс и ε всегда возрастают, когда титруемая группа (например, ОН тирозина и SH цистеина) заряжена.

Следовательно:

а) если не наблюдается изменений в спектре одной из этих аминокислот, а рН таково, что должна бы происходить ионизация свободной аминокислоты, то она должна быть спрятана в неполярной области молекулы белка;

б) если значение рК ионизуемой группы аминокислоты, определенное по изменению спектра при изменении рН, такое же, как для свободной аминокислоты в растворе, то эта аминокислота находится на поверхности белка;

в) если значение рК, определенное по изменению спектра при изменении рН, существенно другое, то эта аминокислота, вероятно, находится в очень полярном окружении (например, тирозин, окруженный карбоксильными группами).

3. Величина ε пуринов и пиримидинов понижается по мере того, как плоскости их колец становятся параллельными, и кольца сближаются друг с другом (по мере увеличения стэкинга). Величина ε понижается в следующем ряду: свободное основание > основание в составе одноцепочечного полинуклеотида, не имеющего стэкинга, > основание в составе одноцепочечного полинуклеотида со стэкингом > основание в составе двухцепочечного полинуклеотида.