РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК НА СЕКВЕНАТОРЕALFexpress II DNA

Рис. 1.17. Внешний вид автоматического секвенатора ALFexpress DNA Analysis System (США)

Технические характеристики

Прибор представляет собой электрофорезную камеру, в которой детекция сигнала основана на возбуждаемой лазером флуоресценции фрагментов ДНК, меченых особым флуорофором. Прибор позволяет одновременно анализировать 10 образцов.

Программное обеспечение позволяет получать предварительный результат в реальном времени и осуществлять анализ нуклеотидных последовательностей по окончании электрофореза

Задания на выполнение лабораторной работы

Задание 1.5.1. Приготовление смесей дНТФ/Cy5 ддНТФ

Порядок выполнения работы

1.Для этого протокола праймеры должны иметь приблизительно 50 %-

йGC-состав и длину не менее 19 н.п. Матрица: 1-2 мкг плазмидной ДНК (до 8 тыс. нп) и около 2-5 пикоМ праймера.

2.Пометить четыре микропробирки “A”, “C”, “G”, “T” для приготовления соответственных смесей меченых терминаторов ( в мкл ).

РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК НА СЕКВЕНАТОРЕALFexpress II DNA

3.К каждую пробирку добавить компоненты, указанные в табл. 1.2 Объемы, соответственно, указаны для 10- и 5-сиквенсовых реакций. 10% (2 микролитр) – на потери при пипетировании.

4.Хранить смеси дНТФ/Cy5-ддНТФ во льду в темноте до употребления.

1.Для каждой матрицы, пометить четыре ПЦР-микропробирки (0,5 мл ) “A”, “C”, “G”, и “T”. (20 для 5 реакций, 40 для 10 реакций).

2.Внести по 2 мкл C -смеси в пробирку, меченую “C”. Аналогично, внести 2 мкл каждой смеси в оставшиеся пробирки для G и T.

3.Для каждого комплекта из четырех реакций (один образец), приготовить реакционную смесь комбинацией следующих компонентов в одной пробирке (табл. 1.3). Мягко смешать пипетированием.

4.Распределить по 22 мкл реакционной смеси без ДНК в пустые микропробирки, меченые “A”. Тщательно смешать.

РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК НА СЕКВЕНАТОРЕALFexpress II DNA

5.Добавить 2 мкл ДНК-матрицы (0,5 мкг/мкл, до 1 мкг всего) в каждую пробирку с реакционной смесью, меченую “A”, смешать пипетированием и распределить по 6 мкл полной реакционной смеси с ДНК в каждую пробирку, содержащую C-смесь, G-смесь и T-смесь.

6.Добавить по 2 мкл A-смеси в пробирки, меченые “A”.

7.Отцентрифугировать пробирки быстро, если необходимо.

8.Провести 30 циклов ПЦР со следующими параметрами:

элонгация: 72 ˚C 1 мин 20 сек I

хранение при 4 ˚C, но лучше удалять немедленно.

Задание 1.5.3. Осаждение и нанесение образцов на гель

1.Альтернативно образцы могут быть приготовлены для нанесения на гель при использовании колонок AutoSeq™ G-50.

2.Смешать 2 мкл 7,5 M ацетата аммония и 2 мкл раствора гликогена на каждую реакцию: 90 мкл 7,5 M ацетата аммония + 90 мкл раствора гликогена для 40 реакций (10 матриц).

3.Добавить по 4 мкл смеси гликоген-ацетат аммония в каждую пробирку, отцентрифугировать и перемешать на встряхивателе.

РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК НА СЕКВЕНАТОРЕALFexpress II DNA

4.Добавить по 35 мкл 95 %-го этанола в каждую пробирку и перемешать на встряхивателе. Инкубировать при минус 70˚C 20 мин или при минус

20 °C ночь.

5.Центрифугировать 16 000 g 15 мин при комнатной температуре (!) для осаждения ДНК.

6.Супернатант осторожно удалить на водоструйном насосе и промыть каждый осадок 100 мкл 70 %-го этанола. Центрифугировать 16 000 g 5 мин.

7.Осторожно удалить на водоструйном насосе супернатант и высушить его на воздухе (~ 15 мин). Не пересушивать! Иначе трудно будет растворить осадок.

8.Тщательно (!) ресуспендировать каждый осадок в 8 микро л Стопраствора (100 %-й формамид с краской). Растворение проверить визуально!

9.Денатурировать ДНК нагреванием до 72 °C в течение 3 мин и сразу же поместить их в лед. Осторожно! Перегрев образцов приводит к резкому снижению сигнала от больших фрагментов.

10.Держать готовые образцы во льду до нанесения на гель.

11.Нанести в лунки половину каждой реакции для геля толщиной 3 мм

ивесь объем каждой реакции для геля в 5 мм. Провести электрофорез при стандартных условиях.

Задание 1.5.4. Заливка геля и постановка электрофореза

1.Снять внутренние напряжения с термоплаты путем присоединения

еек водным коннекторам на несколько секунд.

2.Отсиланить чистые стекла раствором Bind-Silane: 1 мл этанола, 250 мкл 10 %-й уксусной кислоты, 3 мкл Bind-Silane.

3.Нанести несколько капель на верхние 2-3 см термоплаты и на вер х- ние 5 см стекла.

4.Вымыть стекла детергентом и высушить.

5.Собрать кассету для заливки геля: спейсеры, гребенка, зажимы равномерно распределить по сторонам кассеты.

6.Для 3 мм геля разделить пополам содержимое двух баночек с компонентами Long Read Solution или High Resolution. Слить осторожно половинки вместе, размешав без пузырей.