РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА 6.10. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ И ТЕРМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ

Рис. 6.20. Внешний вид прибора для комплексного термического анализа

STA 449 Jupiter (NETZSCH, Германия)

Технические характеристики прибора для СТА – STA 449 Jupiter:

•температурный диапазон от 20 °С до 1500 °С;

•скорость нагрева от 0,3 до 20 °С/мин;

•диапазон масс образцов (ТГ) до 5 г;

•дрейф весов < 1 мкг/ч;

•воспроизводимость базовой линии (ДСК – дифференциальная сканирующая калориметрия) ±2 мВТ;шум ДСК– ~1 мкВт;

•программное обеспечение позволяет проводить измерения и расчеты данных ДСК, ДТА, ТГ, ДТГ; имеется набор образцов для калибровки температуры и энтальпии.

Задания на выполнение лабораторной работы

Задание 6.10.1. Снятие ИК-спектра полигидроксибутирата

Порядок выполнения работы

1. Произвести градуировку прибора по плёнке полистирола. Для этого пленку следует закрепить в держателе кюветы; поместить кювету в прибор и записать ИК-спектр в соответствии с инструкцией к спектрофотометру.

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА 6.10. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ И ТЕРМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ

2.Полученный спектр сравнить со спектром эталона по характерным полосам поглощения в интервале 3160–2780 и 2000–570 см-1.

3.Снять ИК-спектр мономера (стирола). Для этого каплю жидкого мономера поместить между двумя окошками разборной кюветы, закрепить их в держателе и установить в рабочем канале спектрофотометра. Записать спектр исследуемого мономера в широком интервале длин волн. По справочным данным интерпретировать наиболее интенсивные полосы поглощения исследуемого мономера.

4.Снять ИК-спектр раствора полигидроксибутирата (ПГБ). Собрать две кюветы с произвольно выбранной, но одинаковой толщиной слоя и заполнить одну из них растворителем, а другую – раствором полимера заданной концентрации. Поместить кюветы в спектрофотометр и произвести ориентировочную оценку спектра раствора. Если спектр нечёткий и не вписывается в шкалу оптической плотности (пропускания), то следует изменить первоначально выбранную толщину слоя и повторно произвести ориентировочную оценку спектра. Найдя опытным путем оптимальную толщину слоя раствора, записать его спектр в широком интервале длин волн 500-4000 см-1. Далее по справочным данным интерпретировать спектр по наиболее интенсивным полосам поглощения.

5.Снять ИК-спектр образца твердого полигидроксибутирата. Для этого образец в виде плёнки поместить между окнами разборной кюветы, закрепить в держателе и установить в рабочем канале спектрофотометра. Из порошка полимера приготовить пасту, используя хлороформ, и записать спектр в широком интервале длин волн. Полученный спектр интерпретировать, используя справочными данными.

На рис. 6.21 приведён ИК-спектр полигидроксибутирата из базы дан-

ных OPUS.

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА 6.10. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ И ТЕРМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ

Волновое число, см-1

Рис. 6.21. ИК-спектр стандартного образца полигидроксибутирата из базы данных ИК-спектров OPUS фирмы Bruker

1.На основе расшифровки спектров мономера (стирол) и полимера (полистирол) объяснить наблюдаемые различия.

2.Провести отнесение полос (пиков) поглощения в спектрах полигидроксибутирата. На основе полученной информации провести качественный структурно-групповой анализ.

Задание6.10.2. Определениетемпературфизическихихимических превращений полимеров (температуры плавления и термодеструкции) по кривой ДТА (ДСК) и ТГ

Материалы и оборудование

1.Образец полигидроксибутирата.

2.Оксид алюминия.

3.Дериватограф Q (Венгрия).

4.Тигли.

Порядок выполнения работы

1. Навеску исследуемого полимера (0,1 г) поместить в один платиновый тигель, а в другой – такую же навеску эталонного вещества. Оба тигля

6.

РАБОТА 6.10. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ И ТЕРМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ

поместить в дериватограф на термопары, накрыть кварцевым стаканом, опустить печь (работа согласно инструкции к прибору).

2. На дериватографе записать кривые ДТА, ДТГ, ТГ и Т в виде функций определяемой величины от времени, которые переводят в кривые зависимости от температуры. Это осуществляется при помощи кривой Т, показывающей изменение температуры исследуемого образца во времени. Для нанесения на ось абсцисс температурной шкалы через точки пересечения горизонтальных калибровочных линий температуры и кривой Т опускают перпендикуляры на ось абсцисс и наносят соответствующие значения температур. На основании полученной температурной шкалы определить температуры переходов на кривых ДТА, ДТГ, ТГ, проектируя характерные точки перегибов на ось абсцисс.

На рис. 6.22 в качестве примера приведены результаты термического анализа полимерного материала на основе полигидроксибутирата на приборе СТА фирмы NETZSCH (Германия).

Рис. 6.22. Кривые термического анализа (ДСК и ТГ) полигидроксибутирата (материалы П. В. Миронова)

3. Потерю массы образца (в %) найти на кривой ТГ, пользуясь штриховальной соответствующей шкалой. Определить температуру начала термо-

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА 6.10. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ И ТЕРМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ

деструкции Тн, а также температуры, соответствующие потере 10, 20 и 50 % массы образца полимера – Т10, Т20 и Т50.

4.Проанализировать кривые ДТА, ДТГ и ТГ и объяснить изменения, происходящие при нагревании исследуемого образца полимера.

5.Определить температуры начала, максимума пика плавления и окончания плавления, начала и окончания термодеструкции. Результаты внести в рабочую тетрадь.

4.Проанализировать кривые ДТА, ДТГ и ТГ и объяснить изменения, происходящие при нагревании исследуемого образца полимера.

5.Определить температуры начала, максимума пика плавления и окончания плавления, начала и окончания термодеструкции. Результаты внести в рабочую тетрадь.

Задание6.10.3. Определение истинной температурыплавления кристаллическогополимера(на примереполигидрокисбутирата)

Материалы и оборудование

1.Образец полимера (ПГБ) в виде мелкодисперсного гомогенного по-

рошка.

2.Оксид алюминия (эталон).

3.Дериватограф.

4.Тигли (5 шт.).

5.Весы лабораторные.

Порядок выполнения работы

1.Приготовить 4 навески полимера (ПГБ) (по 0,1 г), внести в тигли.

2.Провести анализ в одинаковых условиях при скоростях нагрева 5, 10,15 и 20 °С/мин в соответствии с инструкцией к дериватографу.

3.Выполнить обработку полученных экспериментальных кривых аналогично приведённой в предыдущей задаче. На кривых ДТА отметить температуры максимумов пиков плавления полимера Т°пл.

4.Построить график зависимости Т°пл от скорости нагрева. Экстраполяцией Т°пл на нулевую скорость нагрева определить истинную температуру плавления полимера.

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА 6.10. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ И ТЕРМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ

5. Проанализировать высоту и форму эндотермических пиков плавления, рассчитать площади пиков и объяснить причину их изменения в зависимости от скорости нагрева. Определить истинную температуру плавления образца ПГБ. Результаты внести в рабочую тетрадь.

Задание6.10. 4. Определениетеплотыплавленияи степени кристалличности полимеров (на примере полигидроксибутирата)

Материалы и оборудование

1.Образец полимера (ПГБ) в виде мелкодисперсного гомогенного по-

рошка.

2.Оксид алюминия (эталон).

3.Дериватограф.

4.Тигли (3 шт.).

5.Лабораторные весы «Adventurer»™ OH–AR2140

6.Бензойная кислота.

Порядок выполнения работы

1.Приготовить навески полимера (по 0,1 г), внести в тигли.

2.Провести анализ в одинаковых условияхв соответствии с инструкцией к дериватографу.

3.Выполнить обработку полученных экспериментальных кривых аналогично приведённой в предыдущей задаче.

4.По кривым ДТА определить температуры плавления исследуемых образцов и определить теплоты плавления по отношению к бензойной кислоте.

5.Рассчитать степень кристалличности полимеров (Сх).

6.Определить теплоту плавления и степень кристалличности исследуемого образца полигидроксибутирата.

7.Все полученные результаты внести в рабочую тетрадь.

Контрольные вопросы

1. Какие основные методы исследования полимеров позволяют определить структуру материала?

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА 6.10. СПЕКТРОСКОПИЧЕСКИЕ И ТЕРМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ

2.Для чего необходимо определение температурных характеристик полимеров?

3.Какие методы исследования позволяют определить температуру размягчения, температуру плавления и термической деградации полимеров?

4.По каким показателям при расшифровке ИК-спектров можно объяснить зарегистрированные различия в образцах полимеров разной природы и структуры?

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА6.11. ПРИМЕНЕНИЕРЕНТГЕНОСТРУТУРНОГОАНАЛИЗАДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯБИОЛОГИЧЕСКИХМОЛЕКУЛ

Цель лабораторной работы

•знакомство с прецизионными физическими методами исследования структуры биологических молекул (на примере полиэфиров микробиологического происхождения – ПГА различного химического состава).

Краткие теоретические сведения

Способность рентгеновских лучей приникать сквозь материалы используют во многих биологических приложениях. Основная проблема при использовании рентгеновских лучей для обнаружения органических материалов состоит в их низком коэффициенте поглощения по сравнению с металлами.

Для установления структуры биологических молекул и макромолекулярных комплексов применяется рентгеновская кристаллография, в которой центральное место отводится технике преобразования Фурье. Связано это с тем, что получаемая дифракционная картина объекта (рис. 6.23) является Фурье-преобразованием его структуры.

Рис. 6.23. Дифрактограммы кристаллизованного полигидроксибутирата дифрактограммы нативных кристаллов сняты: а – на высушенных клетках с содержанием полимера до 60 % , б – ориентированных полимерных волокнах

Существенное значение рентгеновская спектроскопия имеет для изучения полукриталлических полимерных материалов, к которым относятся и полиэфиры микробиологического происхождения – полигидрокисалканоаты. Свойства ПГА определяются их строением, прежде всего, они зависят от

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА 6.11. ПРИМЕНЕНИЕ РЕНТГЕНОСТРУТУРНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯБИОЛОГИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ

строения боковых групп в полимерной цепи, а также от расстояния между эфирными группами в молекуле. На примере только нескольких типов ПГА показано, что свойства этих полимеров значительно меняются в зависимости от типа и соотношения мономеров в полимерной цепи. В результате этого на базе ПГА можно иметь спектр материалов с различными физикомеханическими свойствами, пригодными для различных применений.

Первым среди выделенных и наиболее полно к настоящему моменту охарактеризованным ПГА был полигидроксибутират (ПГБ). Полигидроксибутират (С4H6O2) – это гомополимер D(–)–3–β-гидроксимасляной кислоты, он представляет собой изотактический полиэфир с регулярными повторяющимися единицами (С4H6O2). Процесс кристаллизации ПГБ (и других ПГА) имеет место только после экстракции полимера из клеточной биомассы растворителями; кристаллизация полимера находится под кинетическим контролем и ингибируется субмикронными частицами, в оболочках которых ассоциированы белки и фосфолипиды в полимерных внутриклеточных гранулах.

ПГБ – бесцветное полукристаллическое гидрофобное вещество, плотность его аморфной фазы составляет 1,177 г/см3, кристаллической – 1,23-1,26 г/см3. В ПГБ кристаллическая фаза доминирует над аморфной. Молекулы ПГБ имеют форму плотно упакованных двойных спиралей, повторяющихся на расстоянии 5,95 Ă и двукратно закрученных вправо вокруг оси. Конформация спирали стабилизируется взаимодействием карбонил-метильных групп и не зависит от гидроксильных групп. Цепь гидроксибутирата имеет 21 спиральную конформацию, орторомбические ячейки в решетке при пространстве группы P212121 характеризуются следующими параметрами: а=5,76 Ẫ, в=13,20 Ả, с=5,96А. Кристаллическая структура ПГБ исследуется рентгенострутурным анализом ориентированных полимерных волокон (рис. 6.24). Рентгенограммы волокон показали повторение вдоль оси цепи на расстоянии 0,596 мкм плотно упакованных двойных антипараллельных цепей, входящих в орторомбические ячейки решетки. Изолированные монокристаллы ПГБ имеют сетчатую структуру со следующими параметрами осей: короткая 0,3-2,0; длинная 5,10 нм. Толщина одного кристалла составляет 4-10 нм в зависимости от молекулярного веса полимера, типа растворителя и температуры кристаллизации. ПГБ в кристалле формируют сферолиты при кристаллизации из расплавов в твердофазное состояние.

С использованием рентгеноструктурного анализа выявлено доминирование в полигидроксибутирате кристаллической фазы над аморфной. Сте-

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА 6.11. ПРИМЕНЕНИЕ РЕНТГЕНОСТРУТУРНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯБИОЛОГИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ

пень кристалличности различных образцов ПГБ мало зависит от условий получения и лежит в диапазоне 0,62-0,80. Типичный рентгеновский спектр этого полимера представлен на рис. 6.24.

Рис. 6.24. Рентгеновский спектр полигидроксибутирата, синтезированого Ralstonia eutropha B5786, степень кристалличности Сх 72 %

(материалы Т. Г. Воловой)

Материалы и оборудование

1.Образцы гомогенного ПГБ и сополимеров ПГБ/ПГВ в виде пленок (или прессованных трехмерных компактов диаметром 5 мм).

2.Рентгеноспектрометр D8 ADVANCE фирмы Bruker (Германия) (графитовый монохроматор на отраженном пучке).

Рентгеновскийавтодифрактометр

На рис. 6.25 представлен внешний вид рентгеновского дифрактометра Bruker D8 ADVANCE. Рентгеновский автодифрактометр предназначен для исследования строения кристаллов. С помощью дифрактометра D8 Advance можно проводить: качественный и количественный анализ кристаллических фаз; определение размеров кристаллитов; анализ температурных изменений кристаллических фаз; анализ микронапряжений. Прибор обеспечивает: расчет параметров кристаллических решеток и поиск фаз, деформационных на-

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА 6.11. ПРИМЕНЕНИЕ РЕНТГЕНОСТРУТУРНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯБИОЛОГИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ

пряжений, величины кристаллитов в порошке вещества, атомного строения вещества, структурных распределенных деформаций.

Технические характеристики

Метод съёмки – Брэгг-Брентано. Конфигурация Θ –2Θ. Точность уст а- новки углов – 0,005°. Режим съёмки – пошаговый или непрерывный. Режим работы трубки – 40 кВ, 40 μА. Люминесцентный детектор регистрирует дифракционную картину рассеяния кристаллом рентгеновского излучения.

Рис. 6.25. Внешний вид рентгенспектрометра D8 ADVANCE, Bruker (Германия)

Исследуемые вещества: Порошкообразный или керамический образец объёмом от 5 мм3 для исследований при комнатной температуре, и 0,2 см3 для исследований при иных температурах. Температурная приставка способна поддерживать любую температуру кристалла в интервале 100÷700 K.

Задание на выполнение лабораторной работы

Задание 6.11.1.Знакомство с прецизионными физическими методамиисследования структуры биологическихмолекул

Порядок выполнения работы

1. Образцы ПГА последовательно помещать в кювете рентгеноспектрометра.

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА 6.11. ПРИМЕНЕНИЕ РЕНТГЕНОСТРУТУРНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯБИОЛОГИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ

2.Используя инструкцию по работе на приборе, снять спектры в пошаговом режиме («scan-step») с шагом 0,040 и 2-секундной выдержкой для измерения интенсивности в точке (режим работы прибора 40 кВ х 40 μА) .

3.Записать полученные спектры (см. пример на рис. 6.26).

4.С использованием ЭВМ произвести обработку полученных спектров, определить соотношение аморфной и упорядоченной фаз; вычислить степень кристалличности (Сх).

5.Сопоставить значения Сх для ПГБ и сополимера ПГБ/ПГВ.

6.Внести полученные спектры и результаты в рабочую тетрадь.

Рис. 6.26. Вид экрана. Образец BiB3O6

Контрольные вопросы

1.Какую информацию о биологических молекулах можно получить, используя рентгеновские измерения?

2.Что показывает величина Сх материала?

3.Как влияет величина гидроксивалерата в ПГА на степень кристаллич-

ности?

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА. 6.12. ОЗНАКОМЛЕНИЕСПРИНЦИПОМРАБОТЫЯМР-СПЕКТРОМЕТРА

Материалы и оборудование

1.Образцы гомогенного ПГБ в виде пленок (или прессованных трехмерных компактов диаметром 2 см), или раствора.

2.ЯМР-спектрометр.

Характеристики оборудования

ЯМР-спектрометр

ЯМР-спектрометр Bruker AVANCE 300 (рис. 6.27). Современный импульсный спектрометр ядерного магнитного резонанса AVANCE AV300, производства фирмы BRUKER BIOSPIN (Германия), в твердотельной модификации, обеспечивающий широкие возможности ядерного магнитного резонанса.

Рис. 6.27. Внешний вид ЯМР-спектрометра Bruker AVANCE 300

Технические характеристики

Магнитное поле – 7,049 Тл. Ларморовская частота протонов -300 МГц Мощность передатчиков 300 МГц — 1 кВт14—122 МГц — 1 кВт Длительность 90° импульса около 2 мкс Исследуемые вещества: Твердое вещество – диамагнитные и парамаг-

нитные кристаллы и порошки. Требуемый объем 0,01—1 см3 в зависимости от рабочего ядра и датчика.

Постоянное магнитное поле 7 Тл, температура образца может изменяться от 150 К до 450 К (некоторые датчики работают в более ограниченном

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА. 6.12. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРИНЦИПОМ РАБОТЫ ЯМР-СПЕКТРОМЕТРА

интервале температур, датчик вращения под магическим углом только при 300 К). Измерение спектров ЯМР твердотельных образцов по различным ядрам в диапазоне температур 120—6000 К, с целью исследования структуры, фазовых переходов, внутренней подвижности. Прецизионные измерения ориентационных зависимостей ЯМР – спектров в монокристаллах при помощи специального датчика с гониометром. Измерения спектров высокого разрешения в порошкообразных образцах, с использованием методики вращения образца под магическим углом

Фурье-спектрометрЯМРвысокогоразрешения

Фурье-спектрометр ЯМР высокого разрешения Bruker AVANCE 200 DPX (рис. 6.28) предназначен для решения ЯМР-томографических задач, включая локальную спектроскопию.

Рис. 6.28. Фурье-спектрометр ЯМР высокого разрешения AVANCE 200 DPX

Технические характеристики

Диаметр «теплого отверстия» криосоленоида (89 мм) за счет уменьшения напряженности постоянного магнитного поля (4.7 Т). В развернутой времени конфигурации спектрометр оснащен широкополосным датчиком, позволяющим кроме протонов (отдельный РЧ канал на 200 МГц) регистриро-

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА. 6.12. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРИНЦИПОМ РАБОТЫ ЯМР-СПЕКТРОМЕТРА

вать спектры ЯМР жидкостей, содержащих ядра многих практически интересных атомов (на частотах 82—13 МГц), при температурах от –100 до +100 0С в 5 -мм ампулах (≈ 0.5 мл). Наличие двух цифровых каналов позволяет повысить чувствительность спектров ЯМР редких изотопов, применяя современные методики типа «подавления протонов», переноса спиновой поляризации и др. С использованием дейтерорастворителей может быть применена стабилизация резонансных условий, обеспечивающая многочасовые накопления слабых сигнал.

С использованием дейтерорастворителей может быть применена стабилизация резонансных условий, обеспечивающая многочасовые накопления слабых сигналов. Кроме спектров атомов водорода, углерода, азота в растворах обычных органических соединений и их смесей, достаточно информативные спектры получаются для изотопов: 31P, 6,7Li, 85,87Rb, 117,119Sn,

10,11B, 129,131Xe, 51V, 23Na, 27Al, 123,125Te, 55Mn, 195Pt, 29Si, 199Hg, 77Se, 133Cs, 35,37Cl,

97Мо и многих других элементов.

Применительно к исследованию полигидрокисалканоатов – полукристаллических полиэфиров микробиологического происхождения, с использованием ЯМР-высокого разрешения для мономолекулярного звена молекулы ПГБ зарегистрированы три возможные изомерные конформации (рис. 6.29) методом ЯМР при измерении протонного спектра 1Н (500 МГц) в дейтерохлороформе при комнатной температуре. Полученные спектры ЯМР показывают, что данный полимер представляет собой изотактический полиэфир с регулярными, одинаково ориентированными последовательными единицами D-(β)-3-оксимасляной кислоты: [−O−CΗ(CH3)−CΗ2−CΟ− ]n.

Рис. 6.29. 13С спектр поли-3-гидроксибутирата (ПГБ)

Спектры ЯМР 13С (125 МГц) и 1Н (500 МГц) образцов ПГБ, синтезированного бактериями R. eutropha В5786 при использовании ими в качестве ис-

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА. 6.12. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРИНЦИПОМ РАБОТЫ ЯМР-СПЕКТРОМЕТРА

точника энергии водорода и углерода углекислоты совпали с высокой точностью с аналогичными спектрами образцов ПГБ, синтезированных R. eutropha Н16 при росте на фруктозе и Bacillus megaterium KM – на глюкозе. Приведенный на рис. 6.30 1Н (500 МГц)-спектр раствора ПГБ в дейтерохлороформе при комнатной температуре иллюстрирует форму мультиплетов для СН-, СН2- и СН3-групп протонного спектра. Полученная форма линии для СН-группировки строго согласуется с теорией, по которой все приведенные на рис. 6.30,б мультиплеты должны быть симметричными.

Анализ констант-дипольного взаимодействия между протонами НА, НВ и НХ в магнитно-изолированном фрагменте, показанном на рисунке, позволил получить данные по трем возможным конформациям, которые обозначены через I, II и III (рис. 6.30, а), обусловлены поворотами вокруг связей Н3СНХС-СНАНВ. С учетом общепринятых теоретических значений для констант, характеризующих транс- и гош-конформации, получено свидетельство о доминировании в полиоксибутирате конформации I и II типа и практическом отсутствии конформации III типа.

Рис. 6.30. Три возможные изомерные конформации (I – транс; II – гош; III – противоположная гош) (а) и прецизионная регистрация отдельных линий спектра 1Н (500 МГц) полигидроксибутирата (б), синтезированого бактериями Ralstonia eutropha (материалы Т. Г. Воловой)

Задание на выполнение лабораторной работы

РАЗДЕЛ 6. СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ МАКРОМОЛЕКУЛ И МЕТАБОЛИТОВ

РАБОТА. 6.12. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРИНЦИПОМ РАБОТЫ ЯМР-СПЕКТРОМЕТРА

Задание 6.12.1. Ознакомитьсяс принципами работыЯМР- спектрометра и методамиопределения элементного состава образцов наоснове полученных спектров

Порядок выполнения работы

1.Образец полимера сооплимеров 3-ПГБ/4-ПГБ (в виде раствора в дейтретированном хлороформе) поместить в кювете ЯМР-спектрометра

2.Используя инструкцию по работе на приборе, провести запись спек-

тра (рис. 6.31).

3.С использованием ЭВМ произвести обработку полученного спектра.

4.Внести полученные спектры и результаты в рабочую тетрадь.

Рис. 6.31. Спектры 1H-ЯМР сополимера 3-ПГБ/4-ПГБ с содержанием 4-ГБ 8.7 % (а) и 16 % (б) (материалы Т. Г. Воловой)

Контрольные вопросы

1. Какую информацию о структуре полимеров можно получить, анализируя данные рентгеноструктурного анализа?

2.Как влияет соотношение аморфной и кристаллической фаз в полимерном материале на его технологические свойства?

3.Насколько информативна ЯМР-спектроскопия при изучение химической структуры биополимеров?