РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

ствуют в подчиненных количествах. Как правило, в природе преобладают изотопы с четным числом протонов и нейтронов. В табл. 11.1 приведены стабильные изотопы легких элементов и их содержание в природе (в атомных

%).

Из-за различий в физико-химических свойствах стабильных изотопов в природных условиях происходит их фракционирование, то есть распределение между двумя фракциями вещества с разными изотопными соотношениями. В биологических системах также идет фракционирование изотопов биогенных макроэлементов, в первую очередь, за счет кинетических характеристик ферментных систем, осуществляющих биосинтез органических соединений, вследствие чего наблюдается специфическое закономерное распределение изотопов между биомолекулами, а также дифференциация изотопного состава между организмом и окружающей средой. Например, в результате работы фермента фотосинтеза Рубиско (рибулозобисфосфаткарбоксилаза) атмосферный углекислый газ обогащается, а углеводы, синтезируемые этим ферментом, наоборот, обедняются тяжелым изотопом 13С.

В мировой практике для обозначения изотопного состава вещества принята δ-система, в которой содержание изотопа выражается через изотопный состав некоторого стандарта и измеряется в промилле (‰). Так, для углерода 13С

где Rпробы = (13С/12С)пробы, Rстанд. – такое же отношение для стандарта. Изотопное соотношение углерода (ИС) в общепринятом PDB-стандарте (СаСО3 в од-

ном из месторождений в Калифорнии), измеренное с помощью специализированного масс-спектрометра, составляет 98,8887672 атомных % 12С и

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

1,1112328 атомных % 13С, что соответствует R = 13C/12C = 0,0112372. Иначе говоря, при измерении изотопов используют не абсолютные величины их отношений, а относительные отклонения от изотопного состава стандартного образца. Положительные значения δ указывают на увеличенное содержание тяжелого изотопа в образце относительно стандарта, а отрицательные значения — на снижение содержания в образце тяжелого изотопа по сравнению со стандартом.

Рис. 11.1. Изотопные соотношения углерода, выраженные в системе δ для разных природных объектов

Благодаря детальному изучению изотопии углерода (рис. 11.1) она наиболее широко используется для целей тестирования и маркирования. В ряде случаев весьма полезным дополнением выступает одновременное измерение изотопного состава азота и кислорода. Оказалось, что ИС окисленного углерода (атмосферный углекислый газ, карбонаты) заметно отличается от восстановленного углерода (природные органические вещества): восстановленный углерод обеднен более тяжелым изотопом 13С. Это различие, очевидно, объясняется тем, что первоисточником углерода в органических соединениях является углекислый газ атмосферы, а поставщиками восстановленного углерода – растения. Работы по применению изотопного анализа к продуктам питания и другим объектам для контроля их качества и установ-

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

ления источника происхождения особенно широко развернулись после оснащения изотопного масс-спектрометра хроматографом и микропечью для сжигания «хроматографического пика». Это позволило измерять ИС углерода в каждом индивидуальном соединении исходной пробы.

Изотопные соотношения нашли эффективное применение для анализа трофических взаимодействий в водных и наземных экосистемах, в качестве «индикаторов» движения органического вещества и энергии по трофической сетям. Большинство работ связано с использованием изотопов углерода 12С/13С) и азота (l4N/l5N) в естественной концентрации, т.е. без применения искусственной метки. Изотопы углерода, которые мало фракционируются в трофических цепях, больше подходят для использования в качестве «индикатора». Напротив, изотопы азота сильно фракционируются в трофических цепях и при деструкции органического вещества, что делает азот менее удобной меткой, но позволяет использовать его в качестве интегрального показателя интенсивности многих экологических процессов.

Изотопные соотношения углерода гетеротрофных организмов отражают изотопный состав их пищевых объектов, поэтому с помощью сравнения ИС углерода у потенциальных пищевых ресурсов решаются задачи определения спектров питания животных. Доля определенного вида пищи вычисляется с помощью так называемых моделей смешивания, базирующихся на ряде допущений (сходный химический состав и эффективность ассимиляции разных ресурсов, отсутствие фракционирования изотопов):

Аи В, α – доля ресурса А в питании. Таким− образом,

α= δδАт −δδВВ.

Для всех трофических цепей характерно фракционирование изотопов азота с накоплением тяжелых изотопов у организмов верхних трофических уровней. Накопление связано, по-видимому, с дискриминацией тяжелого изотопа при формировании выводимых из организма продуктов азотного обмена. Фракционирование изотопов азота в трофической цепи («trophic shift», трофическое обогащение) определяется как разница между изотопной подписью потребителя и пищи:

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

∆δ15N = δ15Nпотребитель – δ15Nпища.

Положительная корреляция между δ15N и позицией животного в пищевой цепи отчетливо проявляется в природных экосистемах и подтверждается в большинстве лабораторных экспериментов, что позволяет определить относительный трофический уровень разных животных в любой экосистеме. По разным оценкам среднее обогащение δ15N на один трофический уровень в водных и наземных экосистемах составляет 2,6-3,4 ‰. Трофическое обогащение зависит от диеты (минимально при питании беспозвоночными и растениями, максимально при питании богатой белком пищей), тогда как статистически значимых различий в ∆δ15N между водными и наземными экосистемами, пойкилотермными и гомойотермными животными и между животными с разным типом азотной экскреции не обнаружено.

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА11.1. ОЗНАКОМЛЕНИЕСПРИНЦИПАМИУСТРОЙСТВАИРАБОТЫ ИЗОТОПНОГОМАСС-СПЕКТРОМЕТРА

Цель лабораторной работы

•освоить принцип работы и познакомиться с основными блоками и программным управлением масс-спектрометра изотопных соотношений в постоянном газовом потоке.

Задачи лабораторной работы

•изучить принцип работы изотопных масс-спектрометров;

•освоить пробоподготовку и химический анализ легких элементов в биологических объектах;

•ознакомиться с программой управления, сбора и данных для элементного анализатора-масс спектрометра.

Краткие теоретические сведения

Масс-спектрометрDelta V Plus

Основные характеристики

Масс-спектрометр Delta V Plus определяет изотопные соотношения легких элементов H/D, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O в постоянном газовом потоке (рис. 11.2). Для этого анализируемые образцы должны быть превращены в простые газы (Н2, CO2, N2, или СО) в соответствующих блоках подготовки проб. Наиболее распространенным блоком является элементный анализатор. Сухую пробу, в оболочке из специальной фольги, помещают в автосамлер анализатора. Далее проба в потоке гелия и кислорода поступает на окислительный реактор, где происходит ее быстрое сгорание. Окислы углерода и азота поступают в восстановительный реактор, где происходит восстановление окислов азота до молекулярного N2. Полученные газы проходят очистку (от паров воды, несгоревших остатков) и разделение на хроматографической колонке. Затем газы в потоке гелия проходят через интерфейс, регулирующий давление потоков, и попадают в ионизационную камеру массспектрометра. Происходит ионизация способом электронного удара, в результате чего формируются положительно заряженные ионы, различающиеся по массе.

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.1. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРИНЦИПАМИ УСТРОЙСТВА И РАБОТЫ ИЗОТОПНОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРА

Рис. 11.2. Изотопный масс-спектрометр Delta V Plus с элементным анализа-

тором Flash EA 1112

Рис. 11.3 Схема анализатора масс-спектрометра изотопных соотношений на примере изотопии углерода

Далее ионы проходят в изогнутую пролетную трубку, расположенную в сильном магнитном поле таким образом, что более легкие ионы приобретают менее изогнутную траекторию движения, чем тяжелые (рис. 11.3). В качестве детекторов ионов служат коллекторы – чашки Фарадея, настроенные на определенные массы. С помощью системы электроумножителей имеется

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.1. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРИНЦИПАМИ УСТРОЙСТВА И РАБОТЫ ИЗОТОПНОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРА

возможность варьировать чувствительность коллекторов в широких пределах (несколько порядков) для одновременного сбора ионов с низкой и высокой концентрациями. Масс-спектрометр Delta V Plus обладает 5-чашечным коллектором; в частности для анализа изотопии углерода использует три центральных коллектора, настроенных на массы 44, 45 и 46.

Очевидно, что ионы с массой 44 содержат только легкие изотопы углерода и кислорода, ионы с массой 45 – изотоп 13С, а ионы 46 несут изотоп 18О. Поскольку ионы 45 и 46 масс встречаются в существенно меньшем количестве, чем ионы 44, то возникает необходимость в соответствующей подстройке коллекторов. Вместе с пробой производят измерение соотношений ионов в газе-стандарте с известными соотношениями изотопов, по этому измерению происходит расчет соотношений в пробе. Затем рассчитывают соотношения имеющихся в молекулах изотопов и соотношения в системе δ, которые выдаются в окончательной таблице анализа. В случае одновременного измерения изотопов двух элементов (например, азота и углерода), в ходе хроматографического анализа производится переключение настроек коллекторов на другие массы.

Материалы и оборудование

1.Масс-спектрометр Delta V Plus определения изотопных соотно-

шений H/D, 13C/12C, 15N/14N, 18O/16O в постоянном газовом потоке, с опцией анализатора элементов С N Flash EA 1112, на ос-

нове газовой хроматографии (Thermo Scientific Corporation, США).

2.Металлические пинцеты и шпатели.

3.Пипетки-дозаторы переменного объема 10÷100 мкл со сменными наконечниками.

4.Лабораторные весы «Adventurer»™ OH–AR2140

5.Вещество-стандарт: мочевина чистоты Analytical grade.

6.Калибровочные газы высокой степени очистки: углекислый газ, азот.

Характеристики оборудования

•точность определения ИС не хуже 0,1 δ, в пробе объемом 0,1 мл;

•быстродействие 0,1 с;

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.1. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРИНЦИПАМИ УСТРОЙСТВА И РАБОТЫ ИЗОТОПНОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРА

•наличие устройств для ввода проб через газовый хроматограф, элементный анализатор (для газообразных, жидких и твердых проб);

•источник ионов по способу электронного удара;

•многоколлекторная система детектирования на коллекторах Фарадея;

•монолитный анализатор с внутренней настройкой линз.

Задания на выполнение лабораторной работы

Задание 11.1.1.Приготовление проб для анализа

Порядок выполнения работы

1.Собранную массу растений и животных довести до постоянного веса

всушильном шкафу при температуре 75 оС.

2.Сухую биомассу измельчить с помощью металлического шпателя в фарфоровой ступке;.

3.Приготовить навески проб массой 2-5 мг.

4.Завернуть каждую из проб в специальный конвертик из одноразовой металлической фольги (поставляется в комплекте с элементным анализатором).

5.Аналогичным образом приготовить пробу стандартного вещества.

Задание 11.1.2.Знакомство с основнымиблоками прибора, запускэлементного анализатора.

1.Ознакомиться с газоподающей, распределительной системой, включающей баллоны с гелием, кислородом, азотом, углекислым газом, водородом, редукторы и газораспределительный щит; открыть баллон с гелием, на выходном манометре должно быть 3 атм;

2.Ознакомиться с устройством элементного анализатора, включающим автосамплер, манометры регуляторы потоков гелия и кислорода, окислительный и восстановительный реактор, осушитель газового потока, хроматографическую колонку (рис. 11.4); включить анализатор (тумблер энергоподачи), выставить интенсивность потока гелия 100 мл/мин;

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.1. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРИНЦИПАМИ УСТРОЙСТВА И РАБОТЫ ИЗОТОПНОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРА

Рис. 11.4. Схема работы элементного анализатора Flash EA 1112

3.Ознакомиться с устройством интерфейса ConFlo: манометрырегуляторы потоков гелия и двух газов-стандартов, система открытых капил- ляров-стаканов, выход на масс-спектрометр двух линий: пробы и газастандарта.

4.Ознакомиться с устройством масс-спектрометра: проверить и включить воздушный компрессор, обеспечивающий работу пневматических клапанов интерфейса, форвакуумный насос, система натекателей, анализирующий комплекс.

Задание 11.1.3. Включение МС,знакомство с программным обеспечением

1.Включить энергопитание, ИБП, затем большой рубильник на задней панели МС.

2.Через 10 мин включить компьютер, открыть окно управляющего комплекса Isodat, выбрать и запустить Instrument Control.

3.Включить насосы, кнопка Pumps верхней строки на передней панели МС, далее происходит откачивание вакуума до 2–3 *10–7 торр, что займет от

3 до 12 ч.

4.Открыть управляющую программу для элементного анализатора Eager, производить пошаговое, по 100 оС, нагревание реакторов; окисли-

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.1. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРИНЦИПАМИ УСТРОЙСТВА И РАБОТЫ ИЗОТОПНОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРА

тельный – 940 оС, восстановительный 650 оС. Температуру колонки выставить на 45 оС.

5.В программе isodat, Instrument Control, Continuous Flow module, вы-

брать конфигурацию conflo и газ СО2 (если работаем на измерение 13С/12С).

6.Капилляр разбавляющего газа в стаканчике пробы должен быть опущен (Split в Instrument Control), а капилляр газа-стандарта в стаканчике

Gas-reference поднят.

7.Открыть CO2 баллон, выставить его давление на манометре интерфейса – 1,5 бара.

8.После прогрева и выхода на постоянную температуру всех зон элементного анализаторапровести подготовку к открытию натекателя – включить нагрев зон, для этого в Instrument Control развернуть панель MS state, включить нагрев натекателя – Inlet valve heater и источника ионов Src Inlet, подождать мин 15–20. Открыть натекатель, контролируя вакуум в Instrument Control, который должен стать 1,3–1,6 х 10-6 торр.

9.Включить источник ионов в верхней строке MS panel управляющей программы. Перед измерениями должно пройти 2-3 ч для уравновешивания. Приступаем к измерениям. Убавить поток гелия на манометре интерфейса до 1-1,5 бар.

10.Проверить уровень газа-стандарта СО2, опустив капилляр в стаканчик gas-Reference управляющей программы. Напряжение должно на коллекторе с массой 44 быть 4–5 В. При необходимости отрегулировать давлением на манометре интерфейса. Поднять капилляр обратно.

4. Калибровку МС (zerotest) для проведения измерений. Ежедневно (а также после различных манипуляций) в начале работы следует провести zerotest:

•в блоке Isodat выбрать и открыть программу Acquisition;

•в панели File Browser – Sequence выбрать последовательность

CO2.seq. Сформировать последовательность: поставить центрирование пика – галка под значком пика,Type – Sample, Method – CO2_zero.met. Запустить анализ – Start, Immediately.

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.1. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРИНЦИПАМИ УСТРОЙСТВА И РАБОТЫ ИЗОТОПНОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРА

Рис. 11. 5. Пример расчета стандартного отклонения для zerotest N2

Данный метод производит 10-кратный последовательный напуск газастандарта (например, CO2) в МС. Каждый напуск происходит в течение 10 с, с интервалами между ними по 20 с. По окончании анализа будет сформиров а- на таблица с изотопными соотношениями для 10 пиков СО2. Необходимо оценить ошибку анализа – выделить ИС-значения 10 пиков, в окне правой кнопки мыши – Calculate, стандартное отклонение St.dev.должно быть не хуже 0,06 (рис. 11.5). В случае превышения данного значения, необходимо по-

вторить zerotest.

Контрольные вопросы

1.Назовите основные составляющие компоненты элементного анали-

затора.

2.Для чего используется магнитное поле в анализаторе массспектрометра изотопных соотношений?

3.Для чего необходим интерфейс между опцией предподготовки пробы и масс-спектрометром?

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.1. ОЗНАКОМЛЕНИЕ С ПРИНЦИПАМИ УСТРОЙСТВА И РАБОТЫ ИЗОТОПНОГО МАСС-СПЕКТРОМЕТРА

4. В каких газах происходит измерение изотопных соотношений легких биогенных элементов?

5. Какова последовательность проведения калибровки МС, для чего она выполняется?

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА11.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕСОДЕРЖАНИЯГАММА-ИЗЛУЧАЮЩИХ РАДИОНУКЛИДОВВБИОЛОГИЧЕСКИХОБЪЕКТАХ

Цель лабораторной работы

•получение теоретических и практических представлений о гам- ма-спектрометрии и основных принципах подготовки проб биологических объектов для измерения в них активности радионуклидов гамма-спектрометрическим методом.

Задачи лабораторной работы

•освоить различные методики подготовки проб для гаммаспектрометрии (сушка, озоление, мокрое сжигание);

•ознакомиться с работой гамма-спектрометра со сверхчистым германиевым детектором, получить практический навык измерения проб и анализа гамма-спектров.

Краткие теоретические сведения

Наземные и водные экосистемы нашей планеты загрязнены техногенными радионуклидами в результате использования ядерного оружия, аварий на ядерных объектах, работы предприятий ядерно-энергетического цикла и пр. (Старков, Мигунов, 2003). Техногенные радионуклиды могут накапливаться в биомассе живых организмов и передаваться по трофической цепи. В организм человека радионуклиды, в основном, попадают с водой и пищей. В настоящее время широко используются различные методы детектирования техногенных радионуклидов в продуктах питания и биоте. Большинство техногенных радионуклидов являются гамма-излучателями, что позволяет определять их содержание в природных пробах одним из самых простых и экспрессных способов детектирования – гаммаспектрометрическим методом. Гамма-спектрометрический анализ позволяет при необходимости проводить неразрушающее измерение образцов и не требует очистки анализируемого образца от мешающих примесей и химического выделения радионуклида. В основе метода лежит взаимодействие гамма-квантов с веществом детектора. Из существующих в настоящее время приборов для анализа спектров гамма-излучения наиболее универсальны являются гамма-спектрометры с детекторами на основе полупроводников

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГАММА-ИЗЛУЧАЮЩИХ РАДИОНУКЛИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

сутствующий повсеместно в биосфере как результат глобальных выпадений после ядерных испытаний.

Фоновые активности 137Cs в биомассе водных растений реки Енисей составляют единицы Бк/кг, активность радиоцезия в пробах биомассы из зоны радиационного загрязнения реки достигает сотни Бк/кг. В пробах биомассы макрофитов, произрастающих в зоне радиационного загрязнения реки, регистрируются такие гамма-излучающие радионуклиды как 60Co, 65Zn, 137Cs, 152Eu и др.

Материалы и оборудование

1.Гамма-спектрометр со сверхчистым германиевым детектором (Canberra, США) с установленным программным обеспечением для анализа спектров (Canberra, США).

2.Сушильный шкаф с принудительной вентиляцией (Binder, Германия).

3.Муфельная печь.

4.Лабораторные весы «Adventurer»™ OH–AR2140

5.Вытяжной шкаф.

6.Нагревательные поверхности.

7.Набор ёмкостей для измерения проб – «геометрий».

8.Реактивы (азотная кислота, перекись водорода) и лабораторная посуда.

9.Пробы биомассы водных растений, рыб, грибов и др. биологических объектов (на выбор).

Характеристики оборудования

Установкадлярегистрацииэнергетическогоспектраγизлучающихрадионуклидов

Технические характеристики:

Установка (рис. 11.7) состоит из детектора на основе сверхчистого германия. Детектор расположен внутри герметичной вакуумной камеры на

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГАММА-ИЗЛУЧАЮЩИХ РАДИОНУКЛИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

медном стержне, другой конец которого помещён в сосуд Дьюара с жидким азотом – криостат (2). Криостат обеспечивает поддержание рабочей температуры детектора на уровне 77 K. Вакуум в системе поддерживается с помощью сорбционного насоса. Сорбент (цеолит), охлаждаемый жидким азотом, позволяет поддерживать вакуум в камере детектора в течение длительного времени. Для снижения фона и повышения чувствительности регистрации детектор установлен внутри конструкции из свинцовых блоков (1) – «свинцовая защита» – экранирующей от внешнего гамма-излучения. Для последующей обработки сигнал с детектора поступает на цифровой мультиканальный анализатор (3), подключённый к компьютеру с программным обеспечением и библиотекой радионуклидов для обработки данных измерений (4).

Детектор γ-излучения из сверхчистого германия представляет собой диод, у которого внутренний объём германия чувствителен к воздействию ионизирующего излучения (Handbook…, 2003), в частности рентгеновского и гамма. Гамма-спектрометр, установленный в лаборатории, настроен для регистрации гамма-излучения с энергией в диапазоне от 30 до 2700 кэВ. Данный детектор характеризуется высокой разрешающей способностью:

•0,92 кэВ при энергии γ-квантов 122 кэВ;

•1,97 кэВ при энергии γ-квантов 1332 кэВ;

иимеет относительную эффективность регистрации 23.9% для энергии γ квантов 1332 кэВ.

Программное обеспечение GENIE-2000 (Canberra, США) позволяет управлять спектрометром, хранить и представлять данные измерений в графической и числовой форме, выполнять математическую обработку данных, включая градуировку по энергии и калибровку по эффективности, идентифицировать изотопы и рассчитывать их активности.

Для идентификации нуклидов и расчётов их активности используются встроенные библиотеки, содержащие сведения об энергииγ -квантов изото-

пов (Gamma-ray…, 1998).

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГАММА-ИЗЛУЧАЮЩИХ РАДИОНУКЛИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

4

1

3

2

Рис. 11.7. Общий вид γ-спектрометрической установки для измерения и анализа спектра γ-излучения (Canberra, США): 1 – свинцовая защита с расположенным внутри полупроводниковым детектором; 2 – криостат (сосуд Дьюара с жидким азотом); 3 – цифровой мультиканальный анализатор сигналов; 4 – компьютер с программным обеспечением

Емкости для измерения проб – «геометрии» – это емкости опреде-

ленной формы и объема, для которых экспериментально определён геометрический фактор путём измерения эталонной смеси радионуклидов в соответствующей банке. Эти данные хранятся в библиотеке программного обеспечения и используют при анализе пробы. В данном измерительном комплексе применяют следующие варианты геометрий: 10 мл, 15 мл, 35 мл, 120 мл, 350 мл и 1 л. «Геометрии» нужны для учета геометрического фактора. Геометрический фактор определяет эффективность регистрации в зависимости от геометрии пучкаγ -излучения, падающего на детектор, и физических характеристик пробы.

Муфельнаяпечьивытяжнойшкаф

Муфельная печь (рис. 11.8) предназначена для термического озоления, т.е. удаления органических веществ из проб биомассы. Озоление проб производят при температуре 450 °С в течение 6-12 ч.

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГАММА-ИЗЛУЧАЮЩИХ РАДИОНУКЛИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Рис. 11.8. Электропечь муфельная лабораторная ПМ-1,0-20 (НПП «Теплоприбор», Россия). Диапазон рабочих температур 200-1000 °С

Вытяжной шкаф (рис.11.9) используется для отвода воздуха, содержащего едкие примеси и мелкодисперсные частица от рабочего места. В данной работе будет использован при концентрировании проб и наполнении «геометрий».

Рис. 11.9. Шкаф вытяжной

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГАММА-ИЗЛУЧАЮЩИХ РАДИОНУКЛИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Задания на выполнение лабораторной работы

Задание 11.2.1.Приготовление проб для анализа

Порядок выполнения работы

1.Подготовка пробы сухой биомассы.

2.Получите пробу биомассы у преподавателя.

3.Измельчить пробу с использованием имеющихся в лаборатории специальных приспособлений (ступка с пестиком, кофемолка и др.). Проба, предназначенная для измерения должна иметь однородную структуру.

Внимание: данные работы проводятся в вытяжном шкафу!

4.Поместить образец в «геометрию», соответствующую его объёму, определите массу пробы на весах.

5.Готовую пробу поместите в полиэтиленовый мешок и аккуратно поставьте на детектор гамма-спектрометра (п. 2).

Задание 11.2.2. Концентрированиепроб

1. Концентрирование проб производят после измерения сухой пробы на гамма-спектрометре в случае необходимости. Если активность радионуклида в пробе не превышает минимально детектируемой активности или определяется не достоверно, пробу можно сконцентрировать двумя способами:

o озолить при высокой температуре в муфельной печи;

o провести озоление химическим способом (мокрое сжигание).

2. Озоление в муфельной печи (все работы проводятся в вытяжном шкафу):

o навеску сухой биомассы помещают в специальные жаропрочные керамические ёмкости (тигли) и ставят в холодную печь;

o золение производится при температуре 450 °С в течение 6-12 ч;

o озолённую пробу после полного остывания вынимают из муфельной

печи.

Внимание: работы с муфельной печью проводятся строго в присутствии преподавателя!

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГАММА-ИЗЛУЧАЮЩИХ РАДИОНУКЛИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Задание 11.2.3.Мокрое сжигание

Внимание: работы проводятся в вытяжном шкафу!

1.Навеску биомассы помещают в термостойкий стеклянный стакан (проба должна занимать не более четверти стакана), заливают концентриро-

ванной (30 %) перекисью водорода (Н2О2), добавляют азотную кислоту (HNO3) до концентрации около 0,1 моль/л.

2.Пробу постепенно нагревают при непрерывном помешивании до полного растворения биомассы.

3.После растворения пробу при необходимости доводят до нужного объёма (упаривают или разбавляют водой).

4.Готовую пробу остужают до комнатной температуры и переносят в геометрию для измерения.

Внимание: работы проводятся строго вприсутствиипреподавателя!!!

Задание 11.2.4. Проверка адекватности калибровкиγ- спектрометра

Данная процедура необходима для контроля качества проводимых измерений природных проб.

Для проведения этой процедуры необходимо:

•взять эталонный источникγ -излучения с известным радионуклидным составом, помещенный в «геометрию», аналогичную той, в которой планируется измерять пробу биомассы;

•провести измерение выбранного эталонного источника, как неизвестной пробы;

•обработать измеренный спектр от эталонного источника и рассчитать удельную активность радионуклидов;

•сравнить полученные данные с паспортными данными источника;

•если отклонение полученных значений от номинала не превышает 10%, то калибровка считается актуальной и можно измерять природные пробы. В противном случае, необходимо провести перекалибровку. Данная процедура проводится только специалистами лаборатории.

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГАММА-ИЗЛУЧАЮЩИХ РАДИОНУКЛИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

Задание 11.2.5. Измерение проби обработка результатов измерения

1. Подготовленную пробу поместите в полиэтиленовый мешок и аккуратно поставьте на детектор.

ВНИМАНИЕ! Будьте осторожны при установке пробы на детектор – верхнее окно кожуха детектора представляет собой тонкую бериллиевую мембрану.

2. Работа в GENIE-2000:

•записать описание пробы в журнал измерений;

•восновном меню Genie PROcount выберете пункт «А. Измерение образцов»;

•в открывшемся окне выбрать нужную геометрию;

•ввести время измерения (в с);

•ввести описание пробы;

•записать номер файла в журнал измерений.

Измерение пробы проходит в течение заданного времени без участия оператора. По ходу измерения данные автоматически записываются в памяти мультиканального анализатора и выводятся в окне набора спектра на компьютере. По окончании заданного времени измерение прекращается и данные автоматически сохраняются в файл.

3. Обработка результатов измерения:

• в основном меню Genie PROcount выбрать пункт «G. Управление системой»;

• в открывшемся меню выбрать пункт «С. Набор и анализ гамма - спектров»;

• открыть файл со спектром:

C:\PCNT2K\Camfiles\#Геометрия#\#NNN#.CNF, где #NNN# –

номер файла;

• проанализировать спектр;

Результаты анализа автоматически сохраняются в файле с расширени-

ем RPT (C:\PCNT2K\Repfiles\#NNN#.RPT).

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ГАММА-ИЗЛУЧАЮЩИХ РАДИОНУКЛИДОВ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ

4. Представить полученные результаты в виде табл. 11.2

Контрольные вопросы

1.Для чего и в каких случаях возникает необходимость концентрировать пробы биомассы?

2.Почему для измерений проб используют определенные ёмкости – «геометрии»?

3.Какие гамма-излучающие изотопы всегда присутствуют в пробах биомассы?

4.Опишите процедуру контроля качества измерений. Для чего необходимо её проводить?

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА11.3. ИССЛЕДОВАНИЕТАКСОНОМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПРИРОДНОГОФИТОПЛАНКТОНАМЕТОДОМАНАЛИЗАФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ПОЛЕЙ

Цель лабораторной работы

•знакомство с флуоресцентными методами исследования состава и физиологических характеристик микроводорослей различных таксономических групп.

Краткие теоретические сведения

С помощью различных режимов задержки регистрации флуоресценции в диапазоне от 0 до 50 мкс изучаются особенности смещения пиков и уровня интенсивности свечения исследуемых видов водорослей. Анализ полученных спектров дает четкое представление об основных принципах, лежащих в основе современных флуоресцентных методов изучения состава и физиологических характеристик природного фитопланктона. С помощью планшетного спектрофлуориметра SpectraMax M5e (Molecular Devises, USA)

выполняется анализ флуоресцентных полей лабораторных культур зеленых, синезеленых, диатомовых и криптофитовых водорослей. Регистрация флуоресценции проводится при возбуждающем свете в диапазоне 350– 40 нм и регистрации 410–760 нм с шагом 10 нм. На основе полученных спектров строится трехмерная поверхность распределения сигнала. Определяются характерные пики флуоресцентного свечения микроводорослей разных таксономических групп.

Флуоресцентные методы часто используются в количественных исследованиях структуры фитопланктонных сообществ. Преимущество методов заключается в быстроте (экспрессности) анализа и высокой чувствительности. Значительное количество работ посвящено исследованию флуоресцентных полей для оценки биомассы и таксономической структуры фитопланктона как морских, так и пресноводных экосистем. Регистрация характерных флуоресцентных сигналов пигментов, входящих в системы фотосинтеза (Хл. а, b, c, фикобилины и др.) различных таксономических групп микроводорослей, создает основу для изучения структуры фитопланктонного сообщества. Характерные длины волн некоторых флуоресцирующих пигментов представлены в табл. 11.3.

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПРИРОДНОГО ФИТОПЛАНК

Вместе с тем, необходимо помнить, что флуоресцентные методы не могут дать полные сведения о видовом разнообразии исследуемого фитопланктона. Это связано как с ограниченным количеством типов флуоресцирующих пигментов, так и со схожим набором данных пигментов у разных отделов водорослей, например Chrysophyte и Cryptophyte. Таким образом, наиболее полные и адекватные сведения о структуре сообщества микроводорослей можно получить, сочетая флуоресцентные методы с традиционными методами счета клеток фитопланктона под микроскопом и молекуляр- но-биохимическими методами идентификации видового состава микроорганизмов.

Таблица 11.3

Флуоресцентные характеристики важнейших пигментов микроводорослей. Максимальный пик флуоресценции регистрируется при соответствующей длине волны возбуждающего (ex) и регистрируемого (em) света

Применение метода позволяет получить флуоресцентное поле исследуемого сообщества. Пример поверхности распределения флуоресцентного сигнала сообщества фитопланктона озера Цюрих (Швейцария) представлен на рис. 11.10.

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПРИРОДНОГО ФИТОПЛАНК

Характеристики оборудования

Лабораторные культуры выращивают на жидких средах на термостатируемом люминастате. Для выращивания Chlorella vulgaris используется среда Тамия, для Microcystis sp. – среда Циано, для Lyngbya contorta – среда Громова №6, для Cyclotella sp. и Cryptomonas salinus – модификации среды Чу №10. Пробы для флуоресцентного анализа отбираются из накопительных культур в условиях стерильности в ламинарном боксе.

Работы выполняют с использованием ламинарного шкафа Purifier Delta, класс II, тип A2, модель 3620924 (рис. 11.11).

Ламинарныйшкаф

Технические характеристики

Ламинарный шкаф Purifier 3620924 – модель с УФ лампой, имеет 20 см рабочее окно; работает от напряжения 230 В.

Рис. 11.11 Ламинарный шкаф

Ламинарный шкаф имеет подставку с телескопическими ножками. Высота рабочей поверхности может варьировать от 76 до 91 см. Модель оснащена съемными HEPA – фильтрами, обладающими 99,99 % эффективностью

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПРИРОДНОГО ФИТОПЛАНК

задержки частиц 0,3 мкм. Ламинарный поток воздуха движется в одном направлении с одинаковой скоростью. Прямой поток воздуха создает «воздушную завесу», которая не дает аэрозолям покинуть пространство шкафа. 70 % воздуха циркулируют внутри шкафа и только 30 % уходят наружу, что является ключевым условием обеспечения биологической безопасности.

Вакуумныйнасос

Технические характеристики вакуумного насоса Welch 2546C-02A (рис. 11.12):

•вакуум/Давление: до 60 Тор, 106 Па;

•производительность 38 л/мин;

•безмасленный и безводный;

•имеет удобный регулятор вакуума/давления;

•снабжен клапаном защиты

от попадания жидкости в Рис. 11.12. Вакуумный насос Welch 2546C-02A

поршневой механизм.

Спектрофлуориметр

Показатели флуоресценции микроводорослей регистрируют в автоматическом режиме с помощью спектрофлуориметра SpectraMax 5e (рис. 11.13).

Технические характеристики

Спектрофлуориметр SpectraMax M5e является многофункциональным устройством, позволяющим регистрировать абсорбцию света в УФ- и видимом спектре (Abs), интенсивность флуоресценции (FI), флуоресцентную поляризацию (FP), замедленную флуоресценцию (TRF) и люминесценцию (Lum). Устройство также имеет отдельный порт для кювет, позволяющий проводить анализы Abs, FI и Lum. Система имеет два сканирующих монохроматора, позволяющих задавать оптимальные длины волн возбуждающего и

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПРИРОДНОГО ФИТОПЛАНК

регистрируемого света. Патентованная система PathCheck® автоматически определяет длину оптического пути в ячейках микропланешток по эквивалентному пути в 1-сантиметровой кювете. Микропланшетная система (microplate reader) позволяет за один цикл проводить измерения до 348 проб, в з а- висимости от типа используемых микропланшеток.

Рис. 11.13. Внешний вид планшетного спектрофлуориметра SpectraMax M5e

Режим измерения флуоресценции (FI и TRF): Порт: кюветы и микропланшеты.

Формат микропланшеток: 6, 12, 24, 48, 96, 384 ячеекю Источник света: ксеноновая импульсная лампа (1 Дж/вспышка). Детектор: 2 фотоумножительные трубки.

Время работы шейкера: от 0 до 999 с.

Контроль температуры: от 2°С выше окр. среды до 60 °С. Дипазон: 250-850 нм.

Шаг 1 нм.

Ширина пропускания: 9 нм (возбуждающий) и 15 нм (регистрируемый).

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПРИРОДНОГО ФИТОПЛАНК

Задание на выполнение лабораторной работы

Задание 11.3.1. Определениехарактерных пиков флуоресценции зеленых, синезеленых,диатомовых икриптофитовых водорослей.

Порядок выполнения работы

1.Из колбы, содержащей накопительную культуру исследуемого вида микроводорослей, отобрать квоту 5 мл. Плотность накопительной культуры должна составлять 107 кл/мл. Операцию проводят стерильно в ламинарном шкафу. Последующие операции не требуют соблюдения стерильности. Квота разводится в водопроводной воде объемом 500 мл, предварительно отфильтрованной через бактериальный фильтр (0,2мкм).

2.Около 200 мл полученной культуры необходимо профильтровать через мембранный фильтр 0,45 мкм для оценки уровня фонового сигнала.

3.Шесть ячеек микропланшетки (Corning, 12 ячеек) заполняют культурой микроводорослей и шесть отфильтрованной водой (фон). В каждую ячейку вносится 4 мл пробы.

4.Заполненная пробами микропланшетка помещается в устройство чтения спектрофлуориметра SpectraMax M5e. С помощью программы SoftMax Pro 5.2 задаются все необходимые параметры анализа. Длина волны возбуждающего света находится в диапазоне 350 – 740 нм с шагом 10 нм, регистрация флуоресценции осуществлялась в диапазоне 410 – 760 нм также с шагом 10 нм. Регистрация флуоресценции начинается на 20 нм выше длины волны возбуждающего света, чтобы избежать перекрытия сигналов возбуждающего света и регистрируемой флуоресценции.

5.Текстовой файл с результатами экспортируется в графический пакет, позволяющий строить трехмерные поверхности (например, Surfer, Statistica, Excel). С помощью выбранной программы строится флуоресцентное поле исследуемого вида микроводорослей. По осям X и Y задаются длины волн возбуждающего света и регистрируемой флуоресценции, по оси Z – значения полученного чистого сигнала флуоресценции (фоновые значения вычитаются из общего сигнала). Пример флуоресцентного поля Plankthotrix rubescence A7 представлен на рис. 11.10.

6.Из анализа полученной поверхности необходимо определить длины волн возбуждающего и регистрируемого света, при которых возникают пики

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА 11.3. ИССЛЕДОВАНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ ПРИРОДНОГО ФИТОПЛАНК

свечения. Сделать предположения, какие биохимические вещества отвечают за образования данных пиков.

7.Сравнить различия в местоположениях пиков свечения для зеленых, синезеленых, диатомовых и криптофитовых водорослей.

8.На основе полученных моделей свечения исследуемых культур дать оценку таксономического состава микроводорослей природного сообщества (фитопланктон озер Шира, Шунет).

9.Исследовать изменения флуоресценции зеленых и синезеленых микроводорослей при регистрации сигнала с разной длительностью задержки (режим TRF)

Контрольные вопросы

1.В чем заключаются принципиальные отличия флоуресцентных полей зеленых, синезеленых, диатомовых и криптофитовых водорослей?

2.Какие пигменты отвечают за возникновения пиков флуоресценции в исследуемых культурах?

3.Как изменяется флуоресценции зеленых и синезеленых микроводорослей при регистрации сигнала с разной длительностью задержки (режим

TRF)?

РАЗДЕЛ 11. БИОФИЗИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ СОСТОЯНИЯ ОБЪЕКТОВ ПРИРОДНОЙ СРЕДЫ

РАБОТА11.4. ОПРЕДЕЛЕНИЕСОДЕРЖАНИЯNH4+ иPO43- ИОНОВВ ПРИРОДНЫХВОДАХМЕТОДОМАВТОМАТИЧЕСКОЙФОТОКОЛОРИМЕТРИИ

Цель лабораторной работы

• изучение метода автоматической фотоколориметрии.

Краткие теоретические сведения

Ионы различных солей, содержащих азот и фосфор, в первую очередь аммонийные и ортофосфорные, являются повсеместными компонентами природных вод. Эти ионы служат основным источником биогенных элементов – азота и фосфора, для водной биоты, поэтому их точное и оперативное определение считают важной частью практически любых гидроэкологических исследований и мероприятий, направленных на контроль состояния водных экосистем.

В основу определения ионов аммония и ортофосфатов положены «цветные» реакции этих ионов со специфическими реагентами и фотоколометрическое измерение образовавшихся продуктов реакций. В случае определения ортофосфатов по методу Мерфи и Райли, образуется ярко-голубая окраска раствора за счет реакции между ионами ортофосфата, молибдата и антимонилтартрата и последующим восстановлением комплекса аскорбиновой кислотой. Оптическая плотность полученного раствора измеряется при 880 нм. При определении ионов аммония по методу Берчелота, в реакции образуется зелено-голубой комплекс, а оптическая плотность измеряется при 660 нм.

Материалы и оборудование

1.AutoAnalyzer 3 (Германия) с компьютером, принтером и программным обеспечением (рис. 11.14).

2.Пробы воды из природных водоемов, лабораторных культур.

3.Реактивы для определения ионов аммония:

•30% раствор Бриджи-35, 1 N HCl, сульфат аммония, (NH4)2SO4, натриевая соль дихлороизоциануровой кислоты, двухводная, (ДХИ), натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, (ЭДТА), цитрат натрия, двухводный,

•натрий нитропруссидный, фенол, гидрокись натрия.