РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК НА СЕКВЕНАТОРЕALFexpress II DNA

7.Заливать гель в серединку образовавшейся полости на кассете, выдавливая раствор и постукивая деревянным молоточком интенсивно и равномерно по фронту раствора, чтобы не было пузырей.

8.Перед включением полимеризационных УФ-ламп проверить чистоту верхнего стекла.

9.Включить компьютер и запустить программу ALFWin Control, затем включить секвенатор.

10.Приготовить 2 л электрофорезного буфера х 0,5 TBE.

11.После полимеризации геля удалить лишние куски геля на кассете с гелем и заливочном столике.

12.Вставить кассету геля в секвенатор и включить циркуляцию/подогрев.

13.Залить электрофорезный буфер в верхний и нижний резервуары до

отметки.

14.Осторожно вытащить гребенку из геля и промыть буфером кармашки геля.

15.Нанести формамид (стоп-раствор) в крайние кармашки геля, затем нанести образцы, промывая кармашки непосредственно перед нанесением каждого образца.

16.Вставить электроды, закрыть прибор, включить электрофорез (рекомендованные условия: 1500 V, 60 mA, 25 W, 55˚С температура, 750 мин длительность электрофореза, через 2 с снятие показаний).

Задание 1.5.5. Анализ сиквенсов

1.Закрыть программу сиквенса, выключить приборы.

2.Вымыть и высушить элементы кассеты геля.

3.Откорректировать вручную полученные хроматограммы в программе ALFwin. Проанализировать полученные сиквенсы.

Контрольные вопросы

1.Основные принципы химического секвенирования ДНК.

2.Основные принципы ферментативного секвенирования ДНК.

РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК НА СЕКВЕНАТОРЕALFexpress II DNA

3.Чем автоматическое секвенирование ДНК отличается от ручного?

4.Принцип циклосеквенирования.

5.Особенности проведения электрофореза при секвенировании ДНК.

6.Ферменты, используемые для секвенирования и требования, предъявляемые к ним.

7.Стратегии геномного секвенирования.

РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА1.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕТАКСОНОМИЧЕСКОЙПРИНАДЛЕЖНОСТИ ШТАММОВЦИАНОБАКТЕРИЙМЕТОДОМАНАЛИЗАПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА16S рРНК

Цель лабораторной работы

•использовать молекулярно-генетический метод определения таксономической принадлежности прокариот на основе анализа нуклеотидной последовательности генов 16S рибосомальной РНК

Краткие теоретические сведения

В XX в. проблема систематики прокариот стала насущной в связи со стремительно увеличивавшимся как вширь (описание новых видов), так и вглубь (более детальное разностороннее изучение уже описанных видов) объемом знаний об этих организмах. Важный шаг на пути создания естественной систематики прокариот связан с успехами молекулярной биологии. В 60-х гг. было установлено, что все свойства организма определяются уникальными химическими молекулами – ДНК, поэтому прокариоты могут быть классифицированы путем сравнения их геномов. По такому признаку как генетический материал, стало возможным на основании выявления степени сходства делать вывод о степени родства между организмами.

Выбор рРНК для решения проблем эволюционной систематики прокариот оказался удачным по ряду причин: эти молекулы обнаружены у всех клеточных форм жизни, что указывает на их древнейшее происхождение; их функции всегда одинаковы; первичная структура в целом характеризуется высокой консервативностью. Особенностью рРНК является нахождение вне сферы действия отбора, поэтому данные молекулы эволюционируют в результате спонтанных мутаций, происходящих с постоянной скоростью, и накопление таких мутаций зависит только от времени. Таким образом, мерой

эволюционного расстояния между организмами служит количество нуклеотидных замен в молекулах сравниваемых рРНК или их генов (рДНК).

Известно, что в рибосомах прокариот присутствуют три типа рРНК (5S, 16S и 23S), различающихся молекулярной массой и коэффициентом седиментации. Информационная емкость крупных молекул больше, но их труднее анализировать. Поэтому наиболее удобным оказался анализ молекул рРНК средней величины – 16S, состоящих приблизительно из 1500 нуклеотидов.

РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ШТАММОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

Открытие возможности избирательной амплификации определенных участков ДНК с помощью полимеразной цепной реакции или ПЦР (К. Мюллис, 1985 г.) позволило преодолеть ограничения молекулярно-генетических методов исследования, связанных с недостаточным для анализа количеством ДНК. В основе метода ПЦР лежит возможность репликации молекул ДНК, которая может быть воспроизведена в системе in vitro с помощью ДНКполимеразы, специально подобранной пары олигонуклеотидов-праймеров и смеси дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNTP), которые данный фермент встраивает во вновь синтезируемую цепь ДНК по принципу комплементарности. Процесс амплификации включает повторяющиеся циклы температурной денатурации ДНК (95 °С), молекулярную ассоциацию («отжиг») праймеров с комплементарными им последовательностями на ДНК-матрице (обычно при температуре около 50–60 °С) и последующую матричную достройку полинуклеотидных цепей (начиная от этих праймеров) термостабильной ДНК-зависимой ДНК-полимеразой (обычно при 72–75 °С). Праймеры ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы осуществляется только на участке между ними, удваивая в каждом цикле количество копий данного участка ДНК. Происходит экспоненциальное накопление амплифицируемых фрагментов (ампликонов): за 20-30 циклов амплификации количество синтезированных молекулярных копий исходного фрагмента составит примерно 1 миллион.

Задания на выполнение лабораторной работы

Задание 1.6.1. Выделение ДНК из биомассы водорослей

Материалыи оборудование

1.Музейная культура бактерий или аксенная культура цианобактерий.

2.TE буфер (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, рН 7,6).

3.Фенол (насыщенный 0,2 М Трис-буфером рН 8,0).

4.Хлороформ.

5.SDS (додецилсульфат натрия), 10 %-й р-р

6.Лизоцим, р-р (10 мкг/мкл).

7.Протеиназа К, р-р (10 мкг/мкл).

8.Ацетат натрия 3 М р-р (рН 5,2).

9.Этанол 96 %-й и 70 %-й.

РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ШТАММОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

10.Агароза 1 %-й р-р на 1-кратном ТАЕ-буфере.

11.ТАЕ буфер 50-кратный для электрофореза (2 М Трис, 1 М уксусная к-та, 50 мМ ЭДТА, рН 8,0).

12.Маркеры молекулярной массы, например, ДНК фагаλ, о б- работанная рестриктазой PstI.

13.Автоматические пипетки, стерильные наконечники.

14.Стерильные пластиковые пробирки типа Eppendorf.

15.Микробиологические петли, спиртовка.

16.Центрифуга.

17.Контейнер со льдом.

18.Термостат (37 оС).

19.Водоструйный насос.

20.Бокс-ламинар.

21.Спектрофотометр.

Порядок выполнения работы

1.На всех этапах работы во избежание загрязнения образцов чужеродной бактериальной ДНК должна соблюдаться стерильность! Все водные растворы должны быть стерилизованы автоклавированием или фильтрованием через стерильные 0,2 мкм фильтры, органические реагенты – свежеперегнанными в стерильную посуду.

2.В боксе-ламинаре стерильно перенести одну или несколько отдельных колоний чистой культуры бактерий в пластиковую пробирку, содержащую 247 мкл ТЕ и 20 мкл лизоцима, тщательно ресуспендировать клетки и инкубировать 40 мин при 37 °С.

3.Добавить 30 мкл SDS и 3 мкл протеиназы К. Тщательно перемешать

иинкубировать при 37 °С еще 1 ч.

4.Добавить 300 мкл забуференного фенола, мягко перемешивать смесь 1-2 мин до состояния эмульсии, центрифугировать на максимальной скорости 5 мин.

5.Верхнюю водную фазу, содержащую ДНК, перенести в новую пробирку, не захватывая интерфазу (!), добавить равный объем смеси фенол:хлороформ 1:1, мягко смешивать 10-15 с, центрифугировать на максимальной скорости 2 мин.

РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ШТАММОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

6.Верхнюю фазу перенести в новую пробирку, добавить 1 объем хлороформа, смешивать 10-15 сек, центрифугировать на максимальной скорости 2 мин.

7.Провести осаждение ДНК из раствора этанолом: верхнюю фазу, содержащую ДНК, перенести в новую пробирку, измерить объем и добавить 1/10 объема ацетата натрия, перемешать, добавить 2,5 объема (имеется в виду объем вместе с солью) 96% этанола. Инкубировать во льду в течение часа.

8.Центрифугировать пробирки на максимальной скорости 20-30 мин при 4 °С, отобрать надосадочную жидкость с помощью водоструйного насоса, добавить 200 мкл 70 %-го этанола, несколько раз сильно встряхнуть пробирку, центрифугировать 15-20 мин.

9.Тщательно удалить этанол (Осторожно! После промывки 70 %-ым этанолом осадок может оторваться от стенки пробирки!), подсушить осадок, оставив пробирку открытой на воздухе (не пересушивать!), растворить ДНК в 50 мкл ТЕ. Хранить раствор при 4 °С, длительное хранение при минус 20 °С.

10.Измерить концентрацию ДНК спектрофотометрическим методом либо при помощи электрофореза в 1 %-м геле агарозы.

Задание 1.6.2. Постановка реакцииПЦР

Материалы и оборудование

1.Набор реактивов для ПЦР (поставляется в комплекте): термостабильная ДНК-полимераза, 10-кратный реакционный

буфер, р-р MgCl2 (может поставляться в отдельной пробирке, если буфер не содержит MgCl2).

2.Р-р dNTP.

3.Праймеры.

4.Стерильная деионизованная вода.

5.Фенол.

6.Хлороформ.

7.Ацетат натрия.

8.Этанол 96 %-й и 70 %-й.

9.Агароза 1 %-й р-р на 1-кратном ТАЕ-буфере.

10.ТАЕ буфер 50-кратный для электрофореза.

11.Маркеры молекулярной массы, например, ДНК фагаλ, о б- работанная рестриктазой PstI.

РАЗДЕЛ 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИНЖЕНЕРИЯ НИЗШИХ ОРГАНИЗМОВ

РАБОТА 1.6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ТАКСОНОМИЧЕСКОЙ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ШТАММОВ ЦИАНОБАКТЕРИЙ

12.Автоматические пипетки, стерильные наконечники с фильтрами.

13.Стерильные пробирки для ПЦР.

14.Лабораторный шейкер-вортекс

15.Амплификатор.

16.Центрифуга.

17.Контейнер со льдом.

18.Водоструйный насос.

19.Бокс-ламинар.

Порядок выполнения работы

Примечания по технике работы: поскольку в работе используются универсальные праймеры, специфичные к любой прокариотической ДНК, во избежание контаминации исследуемых образцов чужеродной ДНК необходимо соблюдать особую технику: обрабатывать ламинар ультрафиолетом до и после работы в течение 15-20 мин, для работы использовать стерильные хирургические перчатки, автоматические пипетки для сборки реакционной смеси ПЦР не должны находиться в контакте с бактериальными клетками или ДНК, использовать только стерильные (не автоклавированные) наконечники с фильтрами, открывать пробирки с исходными компонентами для ПЦР-смеси только при помощи специальных приспособлений или простерилизованными металлическими ножницами (не руками!), доставать ПЦРпробирки из пакета только стерильным пинцетом, открывать пробирки с ДНК исследуемых образцов только под ламинаром и только после того, как были добавлены все остальные компоненты ПЦР и закрыты и убраны все исхо д- ные растворы, отбирать ДНК отдельной пипеткой и не оставлять наконечник под ламинаром.

Ни в коем случае не вносить под ламинар и не открывать в нем пр о- бирки с продуктами амплификации!

1.В ламинарном боксе разморозить в ледяной бане все компоненты ПЦР, кроме ДНК-полимеразы. Надеть стерильные хирургические перчатки.

2.Собрать на льду в ПЦР-пробирке смесь для ПЦР (обычно в объеме 20-50 мкл, далее указаны конечные концентрации веществ): реакционный

буфер 1-кратный, 1,5 мМ MgС12, 0,05 мм каждого dNTP, по 10 пмолей каждого праймера, 1-2,5 ед. акт. ДНК полимеразы, стерильная вода, 100 нг ДНК. В отдельной пробирке собрать такую же смесь, не содержащую ДНК, – отрицательный контроль.