РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА7.1. АБСОРБЦИОННЫЙАНАЛИЗПИГМЕНТОВРАСТЕНИЙ

Цель лабораторной работы

•изучение принципов идентификации и количественного анализа пигментов высших растений спектрофотометрическим методом.

Краткие теоретические сведения

Световая волна состоит из взаимно перпендикулярных электрического и магнитного полей, амплитуды которых по мере распространения в пространстве изменяются по синусоиде. Когда волна сталкивается с молекулой, она может либо рассеиваться (т. е. изменяется направление ее распространения), либо поглощаться (т. е. ее энергия передается молекуле). Относительная вероятность протекания того или иного процесса является свойством той молекулы, с которой произошло столкновение. Если произошло поглощение электромагнитной энергии света, о молекуле говорят, что она возбуждена или перешла в возбужденное состояние. Молекула или часть молекулы, которая может быть возбуждена посредством поглощения света в видимой и ближней УФ-области, называется хромофором. Возбужденная молекула обладает набором дискретных квантованных энергетических состояний, описываемых законами квантовой механики. Эти состояния называются энергетическими уровнями молекулы. Самый низкий электронный уровень называется основным состоянием, а все другие — возбужденными.

Поглощение энергии происходит с наибольшей вероятностью только в том случае, если количество поглощенной энергии соответствует разности энергий квантованных состояний. Это можно выразить, констатируя, что свет с длиной волны λ поглощается только тогда, когда

где Е1 — энергетический уровень молекулы до поглощения, а Е2 — энергетический уровень, достигаемый в результате поглощения.

Изменение энергетического состояния при испускании или поглощении кванта называется переходом. Упрощенно переход между электронными энергетическими уровнями соответствует энергии, необходимой для перемещения электрона с одной орбитали на другую. На схеме энергетических

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ

уровней переходы изображаются вертикальными стрелками. Далеко не все переходы реализуются с высокой вероятностью; в реальных системах действуют определенные ограничения, или правила отбора квантовой механики. Зависимость вероятности поглощения от длины волны называется спектром поглощения. Задание абсорбционной спектроскопии состоит в накоплении и анализе данных по поглощению. Если бы все переходы происходили только между самыми низкими колебательными уровнями основного состояния и первого возбужденного состояния, тогда спектр поглощения состоял бы из узких, дискретных линий. Однако поскольку возможны переходы с основного состояния на любой колебательный и вращательный уровни первого возбужденного состояния, а линии имеют конечную ширину, то спектр проявляется в виде относительно плавной кривой. Для большинства молекул длины волн, соответствующие переходам между основным состоянием и любым колебательным уровнем первого возбужденного состояния, лежат в ультрафиолетовой и видимой области спектра.

Вероятность перехода при одной длине волны характеризуется коэффициентом экстинкции при этой длине волны. Если концентрация вещества выражена в г моль/л, а толщина слоя – в см, то этот коэффициент называют

молярным коэффициентом экстинкции и обозначают ε или ελ. Если свет ин-

тенсивности I0 проходит через раствор с толщиной слоя d и концентрацией с, интенсивность прошедшего света подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера:

где ε — молярный коэффициент экстинкции. Результаты измерения выражают либо как процент пропускания T%, либо, гораздо чаще, как поглощение А или оптическая плотность D (иногда ODλ). Эти величины задаются выражениями:

Оптической плотностью удобно пользоваться, так как при d=1 см она равняется ε×с. В некоторых случаях, если свелико, ε становится функцией с, и тогда можно сказать, что закон Бугера-Ламберта-Бера нарушается. Это может быть результатом рассеяния света или структурных изменений (например,

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ

димеризации, агрегации или химических изменений) при высоких концентрациях.

Измерение поглощения осуществляют с помощью спектрофотометра. При описании биохимических образцов почти всегда имеются в виду растворы этих образцов. Несмотря на различия в конструкции все спектрофотометры состоят из источника света, монохроматора (для выделения определенной длины волны), прозрачной кюветы, куда помещается образец, детектора света (как правило, состоящего из фотоэлектронного умножителя ФЭУ) и системы вывода данных (компьютер, дисплей, реже – самописец) для регистрации выходного сигнала детектора (рис. 7.1).

Порядок выполнения работы обычно следующий: измеряют при одной длине волны интенсивность света, прошедшего через кювету сравнения, наполненную растворителем, в котором приготовлен образец (например, буфер или вода), затем следует измерение интенсивности света, прошедшего через раствор изучаемого вещества в том же растворителе. Далее фиксируется изменение в интенсивности света, по которому можно судить о поглощении растворенного вещества. Для получения спектра эта операция повторяется при многих длинах волн. Некоторые приборы, называемые автоматическими двухлучевыми регистрирующими спектрофотометрами, позволяют осуществлять развертку длин волн и одновременно измерять поглощение образца и растворителя (которые находятся в различных кюветах) и фиксировать с помощью электронного оборудования суммированный поток излучений.

Рис. 7.1. Принципиальная схема устройства спектрофотометра

Свет от лампы 1 проходит сквозь монохроматор 2 для выделения пучка света с определенной длиной волны. Монохроматичный свет проходит сквозь кювету с образцом 3 или растворителем 4, помещенную в держатель

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ

для кювет 5, затем попадает на регистрирующее устройство (ФЭУ) 6, сигнал с которого передается измерительному прибору 7.

На рис. 7.2 показаны спектры, снятые в видимой и УФ-областях для двух биологических молекул. Обычно определяют величины D или ε. Длина волны, соответствующая максимуму поглощения, называется λмакс, и именно при этой длине волны обычно определяют ε. Некоторые полосы поглощения состоят из многочисленных пиков, и часто регистрируют длины волн, соответствующие пикам, имеющим меньшие молярные коэффициенты поглощения. Эти длины волн иногда также называют λмакс или указывают, что вещество имеет максимумы поглощения при λ1 , λ2 , λ3, ... λn. Иногда измеряют ширину полосы, хотя и не обязательно.

В табл. 7.1 приведен список величин λмакс и ε хромофоров, часто встречающихся в биологических объектах.

Рис. 7.2. Сравнение спектров поглощения двух биологических молекул: а – флавинмононуклеотида, б – фикоцианина. Спектры можно использовать для идентификации соединения

Спектр поглощения хромофора определяется в первую очередь химической структурой молекулы. Однако λмакс и ε претерпевают заметные изменения и под влиянием окружения. Влияние окружения состоит в следующем.

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ

Таблица 7.1

Максимумы поглощения и молярные коэффициенты экстинкции различных веществ, используемых для биологических исследований, при нейтральном рН

*Поглощение других аминокислот незначительно

Эффект рН. рН раствора определяет ионную форму ионизуемых хромофоров.

Эффект полярности. В случае полярных хромофоров часто справед-

ливо (особенно если молекула содержит О, N или S), что λмакс наблюдается при более коротких длинах волн в полярных растворителях, содержащих

гидроксил (НО, спиртах), чем в неполярных.

Эффекты ориентации. Величины λмах и ε существенно зависят от геометрических особенностей молекул. Наиболее известна гипохромия нуклеиновых кислот, т. е. понижение коэффициента экстинкции нуклеотида, при условии, что нуклеотид входит в состав одноцепочечного полинуклеотида, в котором нуклеиновые основания сближены и расположены друг над другом.

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.1. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ПИГМЕНТОВ РАСТЕНИЙ

Дальнейшее понижение ε наблюдается для двухспиральных полинуклеотидов, так как основания в этом случае еще более упорядочены.

Измерение спектров поглощения биологических препаратов существенно отличается от измерения спектров растворов веществ. Гетерогенность биологических образцов приводит к проявлению эффектов проскока (или сита), светорассеяния. Более подробно узнать о данных эффектах следует из литературных источников.

Задачи, решаемые с помощью абсорбционной спектроскопии в видимой и УФ-областях спектра:

•измерение концентрации;

•исследование скоростей химических реакций;

•идентификация веществ путем спектральных измерений;

•переход спираль — клубок в двухцепочечной ДНК: денатурация и ренатурация;

•спектрофотометрическое титрование белков;

•переход спираль — клубок в белках (денатурация);

•обнаружение связывания с белками малых молекул;

•реакции ассоциации белков.

Материалы и оборудование

1.Дистиллированная вода, этанол или ацетон, лист растения.

2.Оборудование: спектрофотометр Genesis 10UV, автоматические микропипетки.

3.Вспомогательные материалы: ступка, пестик, ножницы, воронка, фильтровальная бумага, марля.

Характеристики оборудования

СпектрофотометрGenesis 10UV

Технические характеристики спектрофотометра Genesis 10UV (Thermo Scientific, USA) (рис. 7.3)