РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.2. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БЕЛКОВ

Материалы и оборудование

1.Растворители: буферные растворы и раствор NaOH (0,1 М), белки, триптофан, тирозин, денатурирующие агенты (концентрированные растворы кислот и щелочей или другие)

2.Спектрофотометр, лабораторные весы «Adventurer»™ OH–

AR2140

3.автоматические микропипетки.

4.Спектрофотометр Genesis 10UV (ThermoSpecronic, США).

Задания на выполнение лабораторной работы

Задание 7.2.1. Приготовление образцов для исследования.

Порядок выполнения работы

1.Получить порошок белка. Рассчитать, навеску какой массы необходимо сделать, чтобы получить 2 мл раствора концентрации 1·10-5 М.

2.Проверьте свои расчеты у преподавателя.

3.Приготовить навеску белка и растворите ее в 2 мл фосфатного буфера (рН 7).

4.Дать раствору постоять не менее 20 мин в темном прохладном

месте.

5.Растворы тирозина и триптофана в двух средах получить у препода-

вателя.

Задание 7.2.2. Измерение спектровпоглощения белка и аминокислот

Порядок выполнения работы

1. Измерить спектры поглощения раствора белка (концентрация 1·10-5 М) в буфере, а триптофана (5·10-5 М) и тирозина (5·10-4 М) в двух средах – растворе NaOH и фосфатном буфере.

Условия измерения: диапазон 260-400 нм, шаг 2 нм ( medium), объем жидкости в кювете – не менее 2 мл.

2. Измерить спектр поглощения денатурированного белка. Для этого доливать маленькими дозами в измерительную кювету с белком и в кювету

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.2. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БЕЛКОВ

сравнения денатурирующий агент, указанный преподавателем. После каждой добавки агента регистрировать спектр поглощения до тех пор, пока спектр не перестанет изменяться.

Задание 7.2.3. Проверка светорассеяния в исследуемых образцах

Порядок выполнения работы

1. Проверить наличие светорассеяния в снятых спектрах, для этого проанализировать, для каких образцов поглощение в диапазоне 320-400 нм не равно нулю.

Составление отчета

1.Спектры поглощения тирозина и триптофана в NaOH. Диапазон длин волн: 260–320 нм. В каждом случае должны быть указана концентрация, отмечены максимумы.

2.Аналогично – спектры поглощения 3-х веществ в фосфатном буфере: белка, тирозина и триптофана.

3.Анализ спектров в виде табл. 7.3.

Таблица 7.3

4. При написании выводов следует обратить внимание на следующие вопросы:

•Схожи ли абсорбционные свойства белка с характеристиками аминокислот (по λmax и/или εmax)?

•Какие из исследованных образцов проявляют рН-зависимость спектров поглощения? Почему?

•Как изменяется спектр поглощения белка при денатурации? Чем это объясняется? Становится ли он более похож на спектры аминокислот?

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.2. АБСОРБЦИОННАЯ СПЕКТРОСКОПИЯ БЕЛКОВ

Контрольные вопросы

1.Что такое первичная, вторична, третичная и четвертичная структуры белков? Какими связями эти структуры удерживаются?

2.Что такое оптическая плотность, пропускание, спектр поглощения? Как спектрофотометр получает эти характеристики?

3.Какие эффекты влияют на спектры поглощения макромолекул?

4.Зависимость между какими характеристиками образца отражена в законе Бугера-Ламберта-Бера? При каких условиях этот закон нарушается?

5.Какие задачи решают с помощью абсорбционной спектроскопии

белков?

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА7.3. АБСОРБЦИОННЫЙАНАЛИЗДНК

Цель лабораторной работы

•освоение спектрофотометрического метода измерения концентрации ДНК и оценки гиперхромного эффекта.

Краткие теоретические сведения

Представление об основах метода абсорбционной спектроскопии в целом следует получить, изучив теоретические сведения к работам 7.1 и 7.2.

Спектры поглощения мономерных нуклеотидов, обусловленные поглощением пуриновых и пиримидиновых оснований, расположены в ближнем ультрафиолетовом диапазоне. Основные полосы поглощения всех нуклеотидов кроме цитидина сосредоточены около 260 нм, у цитидина – при 270 нм. Спектры мономерных нуклеотидов заметно отличаются по форме. Коэффициенты молярной экстинкции мономерных нуклеотидов зависят от природы растворителя, рН, длины волны.

Спектры поглощения ДНК и РНК обусловлены наложением спектров мономерных нуклеотидов; их основная полоса поглощения расположены при 260 нм. Однако поглощение нативной ДНК при 260 нм заметно меньше, чем общее поглощение всех оснований, входящих в ее состав. При переходе от нативной ДНК (полинуклеотида) к мононуклеотидам происходит прирост поглощения – гиперхромный эффект. Гиперхромизм проявляется уже в динуклеотидах (от 2 до 11 %). Эффект возрастает с увеличением дины цепи и достигает максимального значения у олигонуклеотидов из 5-6 остатков. Гиперхромизм проявляется при переходе от двухспиральных структур к односпиральным (однако в меньшей степени, чем при переходе от полинуклеотида к мононуклеотиду). Он обусловлен тем, что в двойной спирали ДНК и в двуспиральных участках РНК плоскости оснований параллельны (и в виде стопок): такая конфигурация приводит к сильному взаимодействию оснований и снижению поглощения. Гиперхромный эффект широко используется как критерий денатурации ДНК. При денатурации значительно (от 20 до 60 % в зависимости от препарата) возрастает оптическая плотность при 260 нм.

Материалы и оборудование

1. Буферный раствор, концентрированный раствор ДНК.

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.3. АБСОРБЦИОННЫЙ АНАЛИЗ ДНК

2. Спектрофотометр, Лабораторные весы «Adventurer»™ OH–

AR2140

3.Водяная баня-термостат WB-4MS фирмы «BioSan», автоматические микропипетки.

4.Спектрофотометр Genesis 10UV (ThermoSpecronic, США).

Задание на выполнение лабораторной работы

Задание 7.3.1. Изучение спектров поглощения нативной, денатурированной иренатурированнойДНК

Порядок выполнения работы

1.Приготовить 4 мл раствора ДНК концентрации 0,2-0,25 мкг/мл в 0,15

МNaCl.

Измерить спектр поглощения этого раствора в диапазоне 200-500 нм. Проверьте наличие светорассеяния, сделайте поправку (если оно есть). Определите коэффициент поглощения данного вида ДНК при длине волны 260 нм.

2. Разлить раствор пополам в две пробирки с плотно притертыми пробками, закрепите пробки резинками и опустите пробирки в горячую водяную баню (около 95 °С).

Выдержав пробирки при такой температуре 10–15 мин, одну из них быстро опустить в лед, а вторую оставить в постепенно остывающей бане.

Дать растворам охладиться до комнатной температуры, измерить спектр поглощения в диапазоне 200–500 нм растворов:

а) денатурированной ДНК (быстро охлажденной), б) ренатурированной (медленно остывшей).

3. По измеренным значениям оптической плотности рассчитать величину гиперхромного эффекта для нативной и ренатурированной ДНК:

ГЭ(%) = D1 − D2 100,

D1

где D1 и D2 – оптические плотности при 260 нм для денатурированной и нативной (ренатурированной) ДНК соответственно.