РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА 5.6. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РОСТА ГРИБАAsprgillus niger ПРИ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

•фокусируемый и центрируемый конденсор Аббе 0.9/1.25 с держателем для фильтров;

•револьверное устройство для крепления 4 и 5 объективов;

•бинокулярная насадка; угол наклона окулярных трубок 45º;

•регулируемое межзрачковое расстояние;

•координатный предметный стол 75×30 мм с керамическим покрыти-

ем.

Для высушивания биологических образцов до постоянного веса предусмотрен сухожарочный шкаф SANYO MOV 112F.

Задание на выполнение лабораторной работы

Задание 5.6.1. Определение показателей роста и спорообразования грибных культур поверхностным и глубинным способом

Порядок выполнения работы

1.Приготовить питательную среду, разлить по 100 мл в стерильные колбы Эрленмейера и простерилизовать в автоклаве при 115 °С в течение 25 мин.

2.Приготовить суспензию конидий гриба A. niger с титром не менее 108 клеток в 1 мл; внести по 1 мл суспензии в стерильную питательную среду.

3.Засеянные колбы разместить в термостате (для поверхностного культивирования) и шейкере-инкубаторе (для глубинного культивирования) при температуре 30 °С.

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА 5.6. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РОСТА ГРИБАAsprgillus niger ПРИ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

Рис. 5.20. Пример построения графика накопления биомассы и лимонной кислоты в культуральной жидкости Aspergillus niger

Таблица 5.6.

Показатели роста гриба Aspergillus niger при различных методах культивирования

Таблица 5.7

Показатели спорообразования гриба Aspergillus niger при поверхностном культивировании

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА 5.6. ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ РОСТА ГРИБАAsprgillus niger ПРИ РАЗЛИЧНЫХ МЕТОДАХ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ

После периода инкубации отделить биомассу мицелия фильтрацией или центрифугированием и высушить до постоянного веса.

5.В культуральной жидкости определить остаточное содержание глюкозы ортотолуидиновым методом.

6.Рассчитать и записать в табл. 5.6 и 5.7 показатели роста и спорообразования.

Контрольные вопросы

1.Что такое периодическая культура?

2.Чем отличаются поверхностный и глубинный способы культивирова-

ния?

3. Какие режимы стерилизации применяют для посуды и питательных

сред?

4. Как рассчитать основные биотехнологические показатели роста гриба в культуре?

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА5.7. ОБРАЗОВАНИЕЛИМОННОЙКИСЛОТЫГРИБОМAspergillus niger

Цель лабораторной работы

•оценить влияние источников углерода на образование биомассы

ибиосинтез лимонной кислоты грибом A. niger в поверхностных

иглубинных культурах.

Задачи лабораторной работы

•получение поверхностной и глубинной культуры гриба A. niger на питательных средах, содержащих различные источники углерода (глюкозу и сахарозу);

•определение биомассы мицелия и накопления лимонной кислоты в культуральной жидкости гриба в динамике; проведение сравнительного анализа показателей.

Краткие теоретические сведения

С помощью микроорганизмов можно синтезировать до 60 органических кислот. Многие из них получают в промышленном масштабе – итаконовая, молочная, уксусная, лимонная, яблочная, янтарная. Эти пищевые кислоты используются как регуляторы кислотности и консерванты. Лимонную ки-

слоту получают с помощью Yarrowia lipolytica, Aspergillus niger, молочную – Endomycopsis fibuligera, Rhisopus oryzae, Lactobacillus casei, янтарную – Anaerobiospirillum succiniproducens. Уксусную кислоту получают путем микробиологической конверсии водорода и углекислого газа бактериями

Acetobacterium woodi и Clostridium aceticum.

Лимонную кислоту широко используют в пищевой, медицинской, фармацевтической, лакокрасочной промышленности и в некоторых других отраслях народного хозяйства.

Около 60 лет назад лимонную кислоту выделяли преимущественно из плодов цитрусовых растений. Теперь же основную массу ее производят с помощью штаммов плесневого гриба A. niger. В настоящее время ведущими производителями лимонной кислоты являются КНР, США, Франция, Россия и некоторые другие страны. Ранее, начиная с 1917 г., производство лимонной кислоты было основано на поверхностном культивировании микробапродуцента; в 1938–1942 гг. освоено также глубинное культивирование в

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА 5.7. ОБРАЗОВАНИЕ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ГРИБОМ Aspergillus niger

герметичных ферментаторах. Благодаря этому удалось механизировать и автоматизировать процесс, эффективнее использовать производственные площади и снизить себестоимость целевого продукта, сократить общую продолжительность технологического цикла, облегчить поддержание асептичности в производственных условиях.

Сейчас в производстве применяют штаммы A. niger, дающие выход лимонной кислоты 98-99 % в расчете на потребленную сахарозу и обладающие повышенной осмотолерантностью.

Лимонная кислота наряду с глюконовой, фумаровой и другими, является интермедиатом метаболизма в цикле трикарбоновых кислот, когда имеет место неполное окисление соединений углерода в аэробных условиях. Ее сверхсинтез возможен при лимитировании гриба-продуцента по железу и фосфору, при одновременном избытке в среде источника углерода и при низких значениях рН. Лимонная кислота накапливается вначале в клетках продуцента, а затем выделяется в культуральную среду.

Вышеперечисленные факторы ингибируют такие ферменты, как акони- тат-гидратазу, изоцитратдегидрогеназу и, возможно, α - кетоглутаратдегидрогеназу. Поэтому не происходит полного метаболизма лимонной кислоты в ЦТК и ее можно получать в достаточно больших количествах с коммерческими целями.

Материалы и оборудование

1.Колбы Эрленмейера на 500 и 750 мл.

2.Мерные стаканы, колбы конические на 250 мл, пипетки градуированные, стеклянные пробирки.

3.Камера Горяева.

4.Реактивы для приготовления питательных сред.

5.0,1 н NaOH; фенолфталеин.

6.Культура гриба A. niger на скошенном агаре.

7.Стационарный рН-метр Sartorius, Meter, (Германия).

8.Микробиологический термостат Binder (Германия).

9.Микроскоп бинокулярный AxioStar plus (Carl Zeiss, Германия).

10.Сухожарочный шкаф SANYO MOV 112F (Япония).

11.Автоклав Sanyo MLS-3781L (Япония).

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА 5.7. ОБРАЗОВАНИЕ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ГРИБОМ Aspergillus niger

12.Шейкер инкубатор JEIO TECH SL-600.

13.Лабораторные весы «Adventurer»™ OH–AR2140 (США).

14.Центрифуга настольная Eppendorf 5810 R (США).

Задание на выполнение лабораторной работы

Задание 5.7.1. Изучение накопления биомассы илимоннойкислоты в динамике) при добавленииразличных источниковуглерода грибомA. niger в поверхностных и глубинных культурах

Порядок выполнения работы

1. Приготовить питательные среды следующего состава (г/л):

Вариант 1. Глюкоза – 30,0, MgSO4 × 7H2O – 0,5, KH2PO4 – 0,5, NH4Cl – 2,0, FeSO4 × 7H2O – 0,01, KCl – 0,5.

Вариант 2. Сахароза – 30,0, MgSO4 × 7H2O – 0,5, KH2PO4 – 0,5, NH4Cl – 2,0, FeSO4 × 7H2O – 0,01, KCl – 0,5, ZnSO4 – 0,05.

2.Разлить в стерильные колбы Эрленмейера по 100 мл и простерилизовать в автоклаве при 115 °С в течение 25 мин.

3.Приготовить суспензию конидий гриба A. niger и провести засев, как описано в работе 5.6.

4.Провести инкубацию в течение 6 сут. Накопление биомассы и лимонной кислоты учитывать в динамике на 2–4–6 сут культивирования.

5.Для установления количества накопившейся кислоты из опытных и контрольных колб взять по 10 мл субстрата в колбу Эрленмейера, добавить 1–2 капли фенолфталеина и титровать 0,1 н раствором NaOH. Разность объемов щелочи, используемой на титрование опытного и контрольного субстратов, показывает количество щелочи, израсходованной на титрование лимонной кислоты. Учитывая, что 1 мл 0,1 н NaOH соответствует 0,0064 г лимонной кислоты, рассчитать, сколько накопилось кислоты в 100 мл субстрата.

6.Построить графики накопления биомассы и лимонной кислоты в динамике (рис. 5.20) при добавлении различных источников углерода.

7.Провести сравнительный анализ биомассы и биосинтеза лимонной кислоты в культурах, выращенных поверхностным и глубинным способами.

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА 5.7. ОБРАЗОВАНИЕ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ГРИБОМ Aspergillus niger

Контрольные вопросы

1. Какие органические кислоты получают микробиологическим спосо-

бом?

2.Какие кислоты продуцируют грибы из рода Aspergillus?

3.Какие метаболические процессы лежат в основе биосинтеза лимонной кислоты?

4.В каких условиях будет происходить накопление лимонной кислоты

вкультуральной жидкости?

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

Подраздел5.3. КУЛЬТИВИРОВАНИЕВОДОРОСЛЕЙ

Цель подраздела

• продемонстрировать возможности управляемого культивирования микроводорослей для физиологических и экологических исследований и овладеть принципами и навыками определения систематического положения с использованием современных молеку- лярно-генетических и биохимических методов.

Задачи подраздела

•освоить технику культивирования альгологически чистых культур микроводорослей;

•освоить методы количественного учета микроводорослей.

Объекты исследования: цианобактерии Anabaena variabilis, зеленые водоросли Scenedesmus quadricauda, Chlorella vulgaris, пробы воды и фито-

планктона из природных водоемов.

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА5.8. ВЫРАЩИВАНИЕМИКРОВОДОРОСЛЕЙВНАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЕ

Цель лабораторной работы

•дать представление о технике выращивания микроводоролсей в лаборатории.

Задание лабораторной работы:

• освоить методы культивирования микроводорослей.

Краткие теоретические сведения

Исторически сложилось так, что к группе микроводорослей относят не только представителей различных отделов эукариотических водорослей (зеленых, диатомовых и др.), но и представителей цианобактерий – прокариотических организмов, имеющих хлорофилл а и осуществляющих фотосинтез с выделением кислорода. Их называют синезеленые водоросли.

Микроводоросли анатимически проще, чем высшие растения; в большинстве своем это водные организмы. Выработанное в ходе эволюции разнообразие проявляется на структуре их фотосинтетического аппарата и составе пигментов. Хлоропласты водорослей отличаются крайним разнообразием своей морфологии. Окраска хлоропластов водорослей обусловлена набором пигментов: хлорофиллов а (с максимумом поглощения 430 нм) и b (с максимумом поглощения 455 нм),α -, β-, γ-, ε-каротиноидов (с максимумом поглощения 456 – 464 нм). По составу фотосинтетических пигментов зеленые водоросли близки к высшим растениям и могут служить удобными модел я- ми для изучения особенностей функционирования фотосинтетического аппарата в различных условиях внешней среды. Прокариотические цианобактерии, помимо хлорофилла а, содержат специальные «антенные» комплексы, называемые фикобилисомами. Они содержат три билихромпротеида: С- фикоцианин, имеющий максимум поглощения при 615 нм, С-фикоэритрин с максимумом поглощения при 560 нм, аллофикоцианин, имеющий максимум поглощения 650 нм.Функция фикобилисом аналогична функции светособирающих комплексов у других водорослей.

Микроводоросли приспособились к жизни в самых разнообразных условиях и представляют собой удобный объект для исследования не только структурно-функциональных особенностей фотосинтетического аппарата на

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА 5.8. ВЫРАЩИВАНИЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ В НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЕ

клеточном уровне, но и процессов адаптации к условиям внешней среды на организменном и популяционном уровнях. В последнее время в связи с ухудшением экологической ситуации в промышленных центрах возрастает значимость работ по выявлению влияния токсикантов на микроводоросли модельных систем и фитопланктона естественных водоемов, что позволит оценить качество природных вод, подвергающихся загрязнению. Водоросли как тест-объект имеют ряд преимуществ по сравнению с другими гидробионтами: они обладают коротким циклом развития, легко культивируются на искусственных питательных средах, широко распространены в природе и, являясь продукционным звеном трофических цепей, позволяют прогнозировать поведение всех компонентов экосистемы при действии неблагоприятных факторов.

Методика лабораторного культивирования водорослей включает большой комплекс операций, каждая из которых в зависимости от целей и задач работы, биологических и видовых особенностей культивируемого организма, условий проведения работы и характеризуется значительной специфичностью. Наиболее прост метод культивирования в накопительной культуре с принудительной барботацией воздухом при освещении люминесцентными лампами.

Используемые для культивирования водорослей среды разделяются по их консистенции на две категории – жидкие и твердые.

Жидкие среды готовят на водопроводной или дистиллированной воде. Водопроводную воду для приготовления сред отстаивают, кипятят, фильтруют через фильтр или вату. Раствор микроэлементов к водопроводной воде обычно не добавляют. Для приготовления питательной среды водопроводную воду стерилизуют. Дистиллированную воду для питательных сред лучше перегонять в стеклянной посуде, так как металлические дистилляторы загрязняют ее солями тяжелых металлов (цинка, меди), что отрицательно влияет на развитие водорослей. На водопроводной воде культуры водорослей развиваются лучше, чем на дистиллированной.

Адаптированную к условиям культуры водоросль выращивают на питательных средах, приготовленных на дистиллированной воде. Дистиллированную воду для питательных сред лучше перегонять в стеклянной посуде, так как металлические дистилляторы загрязняют ее солями тяжелых металлов (цинка, меди), что отрицательно влияет на развитие водорослей.

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА 5.8. ВЫРАЩИВАНИЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ В НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЕ

Приготовление питательной среды – очень важный этап в технике культивирования водорослей (табл. 5.8). От качества среды в значительной мере будет зависеть характер и интенсивность роста водорослей.

При систематическом культивировании водорослей в больших объемах или при большом количестве повторностей питательную среду удобнее готовить не из навесок солей, а из их концентрированных растворов. Для этого готовят по 100-200 мл растворов основных солей, рассчитывая их концентрации таким образом, чтобы необходимое на 1 л готовой среды количество соли содержалось в 10 или 20 мл концентрированного раствора. Например, для среды №6 концентрированный раствор соли KNO3 должен иметь концентрацию 100 г/л, тогда при добавлении 10 мл этого раствора в 1 л готовой среды конечная концентрация этой соли будет 1 г/л.

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА 5.8. ВЫРАЩИВАНИЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ В НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЕ

Наращивание культуры водоросли производят в конических колбах объемом 0,5–1,0 л при принудительной барбатации воздухом с помощью аквариумных компрессоров на люминостатах (рис. 5.21).

Для предотвращения быстрого испарения среды в систему воздушного потока после компрессора включают склянку Дрекселя с дистиллированной водой. Для поддержания заданной концентрации СО2 в систему газового потока включают 20-литровую емкость с двумя литрами соответствующего кар- бонатно-бикарбонатного буфера Варбурга. Культивирование микроводорослей можно проводить и в специально разработанном для этих целей культиваторе КВ-05. В качестве реактора используют прозрачную бутыль из бесцветного стекла емкостью 400 мл, широко используемую в медицине при переливании препаратов. В реактор заливается суспензия водоросли в объеме 150±10 мл. Для обеспечения углекислым газом, за счет растворения содержащегося в воздухе СО2, емкость с культурой водоросли непрерывно вращается вокруг своей продольной оси. В процессе культивирования суспензию водоросли облучают светом лампы накаливания 40 Вт, 220 В, установленной над реактором. Постоянная температура культуральной среды поддерживается автоматическим включением и выключением встроенного вентилятора по команде блока термостабилизации прибора.

Рис. 5.21. Лабораторный люминостат для выращивания водорослей

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА 5.8. ВЫРАЩИВАНИЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ В НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЕ

Посев водорослей проводится стерильно в специальных боксах. Если водоросль в культуре образует суспензию (гомогенный рост), посев проводят, внося в стерильную колбу с питательной средой определенный объем суспензии (1–50 мл) в зависимости от плотности посевной культуры, объема засеваемой среды.

Колбы после посева устанавливают на стеллажи. Их желательно освещать снизу, что способствует более равномерному освещению.

Контроль за темпом роста и размножением водорослей в культуре можно осуществить на основании учета изменений их численности.

Для учета числа клеток водорослей в культуре чаще всего используется камера Горяева (рис. 5.22). Камера представляет собой стеклянную пластинку (рис. 5.22 а) с отделенной с помощью поперечных желобков средней частью. Высота средней части на 0,1 мм ниже, чем для всей пластинки, благодаря чему при накрывании покровным стеклом в центре пластинки создается камера.

На поверхности средней части пластинки нанесена сетка (рис. 5.22 б) с известной площадью квадратов. Каплю культуры наносят на сетку и пр и- крывают покровным стеклом. Покровное стекло тщательно притирают (для лучшего притирания на боковые поверхности стеклянной пластинки наносят небольшие капли суспензии). После притирания всю лишнюю жидкость вокруг покровного стекла и в желобках осторожно удаляют фильтровальной бумагой или марлей. Под микроскопом подсчитывают в определенном числе квадратов количество клеток водорослей и затем, зная площадь поверхности и высоту камеры, делают пересчет числа клеток на 1 мл суспензии (см. ниже пример расчета).

При подсчете числа клеток в большинстве случаев бывает необходимо развести суспензию в 50, 100, 250 раз и так далее, чтобы в камере вести подсчет при плотности клеток 1,0—2,0 106/см3. Подсчет числа клеток непосредственно в плотных суспензиях дает меньшую точность и более трудоемок.

Пример р а с ч е т а . Площадь самого маленького квадратика, отмеченного на рис. 5.22, в, 1/400 мм2. Высота камеры 1/10 мм, следовательно,

объем камеры, имеющей площадь маленького квадратика, равен 1/4000

мм3.

Так как пересчет ведется на количество клеток в 1 см3 суспензии, то выражаем найденный объем в см3: 1/4*106 см3.

РАЗДЕЛ 5. МЕТОДЫ И АППАРАТУРА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ

РАБОТА 5.8. ВЫРАЩИВАНИЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ В НАКОПИТЕЛЬНОЙ КУЛЬТУРЕ

Рис. 5.22. Счетная камера Горяева: а — общий вид, б — вид сбоку, в — сетка, с помощью которой проводится подсчет клеток

При подсчете числа клеток в камере найдено, что в объеме, соответствующем маленькому квадратику, находится в среднем n клеток. По пропорции:

1/4*106 см3 ………. n клеток 1 см3 ……… ...х клеток

находим, какое количество клеток х содержится в 1 см3 суспензии. При работе с камерой удобно подсчитывать число клеток в 25 больших квадратах. Каждый из таких больших квадратов (взят в рамку на рис. 5.22 в) состоит из 16 маленьких. Следовательно, если общая сумма клеток в 25 больших квадратах равна m, то в одном маленьком квадратике число клеток будет соответственно:

n=m/16*25,

а в 1 см3 суспензии количество клеток составит: x=n*4*106=4m/16*25*106=m/100*106 =m*104.

Таким образом, при просчете 25 квадратов достаточно общую сумму клеток m разделить на 100 и умножить на 106, чтобы сразу иметь число клеток в 1 см3 суспензии.