РАЗДЕЛ 9. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

РАБОТА 9.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ И ТИПОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ С ЭФФЕКТОРАМИ

предложенного ряда несколько эффекторов, основываясь на их физикохимических свойствах. Обоснуйте свой выбор исходя из теоретических представлений о влиянии свойств активатора и\или ингибитора на изменение сродства люциферазы к субстратам.

2.Приготовить рекомендуемые концентрации ферментативного препарата, субстратов и эффекторов.

3.Проверить справедливость кинетики Михаэлиса–Ментен для бактериальной биолюминесцентной реакции.

Задание 9.2.2. Определение типов взаимодействия эффекторов с ферментом по отношению к субстрату

4.Для определения типов ингибирования и\или активации при фиксированных насыщающих концентрациях FMNH2 зарегистрировать кинетику реакции при разных концентрациях альдегида при разных концентрациях одного из эффекторов. Аналогичную процедуру повторить для остальных эффекторов. Как правило, проводится не менее пяти измерений.

5.Статистическая обработка полученных экспериментальных результатов проводится методом наименьших квадратов с использованием пакета программ Excel for Windows 98 или др. Разброс полученных значений не должен превышать 10 %.

6.Тип ингибирования и/или активации, так же как и значения кинетических констант, определить графически с помощью трансформации зависимости Михаэлис-Ментен в координатах Иди-Хофсти, Хейнса, ЛайнуивераБерка и Диксона.

7.В координатах Диксона определить линейность типа ингибирования.

8.Если тип ингибирования нелинейний (см. п. 7), то построить вторичные зависимости ординат точек пересечения с вертикальной осью и наклонов прямых в координатах Лайнуивера-Берка от концентрации ингибитора.

9.Построить зависимости Кm от концентрации эффекторов. Исходя их полученных зависимостей определить, какой тип взаимодействия (гидрофобный или электростатический), главным образом, реализуется между ферментом и соответствующим субстратом при введении данного эффектора

вреакционную смесь. Объясните полученные результаты.

РАЗДЕЛ 9. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ КИНЕТИКИ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ

РАБОТА 9.2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КИНЕТИЧЕСКИХ ПАРАМЕТРОВ И ТИПОВ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ С ЭФФЕКТОРАМИ

10. Оценить изменение сродства люциферазы к субстратам при различных концентрациях эффекторов.

Контрольные вопросы

1.Дайте характеристику типам ингибирования и\или активации фер-

ментов.

2.В чем преимущества формально-кинетического анализа взаимодействия субстратов с эффекторами?

3.Расскажите о графических трансформациях зависимости МихаэлисМентен в координатах Иди-Хофсти, Хейнса, Лайнуивера-Берка и Диксона.

4.Поясните суть метода Диксона для интерпретации механизмов ферментативных процессов.

5.В чем состоит смысл построения вторичных зависимостей ординат точек пересечения с вертикальной осью и наклонов прямых в координатах Лайнуивера-Берка от концентрации ингибитора?

6.Обрисуйте кинетические параметры, характеризующие специфичность действия ферментов, эффективность.

7.Опишите метод формально-кинетического анализа для определения типов взаимодействия (гидрофобный или электростатический), которые могут быть реализованы между ферментом и соответствующим субстратом при введении эффектора в реакционную смесь. Объясните ограничения метода?