РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА3.8. СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕКЛЕТОЧНЫХКУЛЬТУР

Цель лабораторной работы

• приобретение навыков длительного ведения клеточных культур

Материалы и оборудование

1.Культура клеток.

2.Среды и стерильная посуда.

3.Бокс-ламинар Logic ™ (LABCONCO, USA).

4.Термостат BD-115, BINDER (Германия).

5.СО2-инкубатор Innova CO-48.

Задания на выполнение лабораторной работы

Задание 3.8.1. Освоение техники субкультивирования клеток

Порядок выполнения работы:

1.Подготовить среду для роста клеток.

2.Подогреть среду, растворы трипсина с этилендиаминтетрауксусной кислотой (трипсин-EDTA) и фосфатный солевой буфер (PBS) без Са2+ и Mg2+.

3.Слить среду с клеток во флаконе (или планшете).

4.Промыть клетки сбалансированным фосфатным буфером.

5.Добавить трипсин-EDTA (приблизительно 1 мл на 25 см2).

6.Встряхнуть флакон, чтобы накрыть раствором монослой клеток.

7.Экспонировать колбу в термостате при 37°С в течение 4 мин.

8.Проверить под микроскопом отделение клеток от стенки флакона и убедитесь в том, что клетки плавают.

9.Осторожно постучите по бокам флакона, для того чтобы открепить оставшиеся прикрепленными клетки.

10.Добавить культуральную среду во флакон в объеме, равном двойному объему трипсина, и перемешать.

11.Перенести суспензию клеток в центрифужную пробирку.

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА 3.8. СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

12.Центрифугировать пробирку при 200 х g в течение 5 мин.

13.Удалить надосадочную жидкость, не задевая осадок.

14.Встряхнуть пробирку, чтобы поднять осадок.

15.Добавите 1 мл свежей среды, осторожно ресуспендировать клетки пипеткой.

16.Сосчитать клетки, пользуясь красителем трипановым синим и камерой Горяева.

17.Добавить необходимое количество среды во флакон с этикеткой.

18.Добавить необходимое количество суспензии клеток во флакон и перемешать, покачивая флакон.

19.Перенести флакон в термостат. В зависимости от типа клеток процедуру выращивания проводят от нескольких дней до десятков дней. Процедура замены стеры осуществляется через 1–2 дня.

В ходе работы с культурами важно иметь стабильный источник актвиных клеток. Хранение замороженных клеток – это очень важная процедура в культуре клеток. Она позволяет хранить запас клеток в течение продолжительного периода времени (например, многие годы). Она уменьшает риск заражения, риск фенотипических изменений, затраты и необходимость постоянно поддерживать линии клеток в культуре. Она также позволяет осуществлять эксперименты с постоянным числом пассажей культуры клеток.

Задание 3.8.2. Замораживание прикрепленных клеток

Порядок выполнения работы:

1.Приготовить замораживающую среду (10%-ный диметил сульфок-

сид (DMSO) + 90%-ный PBS).

2.Подогреть среду для хранения замороженных клеток, культуральную среду, раствор трипсина с EDTA и PBS (без Са2+ и Mg2+).

3.Выполнить пункты 3-14 предыдущего протокола субкультивирова-

ния.

4. Добавить 1 мл среды для хранения замороженных клеток и при готовить равномерную суспензию клеток посредством многократного осторожного перемешивания с помощью пипетки.

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА 3.8. СУБКУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР

5.Произвести подсчет клеток и разбавьте суспензию клеток средой для хранения клеток, чтобы концентрация составила (2-4) х 106 клеток на мл.

6.Добавить 1 мл суспензии клеток в ампулу с этикеткой (криопробир-

ку).

7.Поместить ампулу в замораживающую колбу (содержащую изопропанол) и оставьте ее на ночь в морозильнике при −80 °С (температура клеток понижается со скоростью 1°С/мин).

8.Перенести ампулу в банк жидкого азота и запишите ее координаты в журнале.

Контрольные вопросы

1. Для чего применяют методы размораживания и замораживания кле-

ток?

2. Какие необходимы реагенты для снятия монослоя клеток при пере-

севе?

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА3.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕИНТЕНСИВНОСТИКЛЕТОЧНОЙПРОЛИФЕРАЦИИВ ММТТЕСТЕ

Цель лабораторной работы

•знакомство с методами определения пролиферативной активности клеток на примере калориметрия с использованием ММТ [3- (4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,50-дифенилтетразолбромида], являющийся индикатором NAD(P)H и сохранности функций митохондрий

Краткие теоретические сведения

Определение состояния клеток с помощью МТТ – это колориметрическая тестовая система, измеряющая восстановление компонента тетразола (МТТ) в нерастворимый продукт формазан желтого цвета в митохондриях живых делящихся клеток. После инкубации клеток с ММТ в среду добавляют детергент, лизирующий (разрушающий) клетки и растворяющий цветные кристаллы формазана. Затем образцы анализируются на фотокалориметре. Интенсивность цвета прямо пропорциональна количеству жизнеспособных митохондрий и живых клеток. Система МТТ – это количественный, более чувствительный тест, чем тест с использованием трипанового синего, поскольку существует линейная зависимость между активностью клеток и их способностью поглощать ММТ; может измеряться скорость роста или гибели клеток. Тест с использованием трипанового синего является качественным и показывает только, жива ли клетка.

Материалы и оборудование

1.Клеточная культура.

2.Термостат BD-115, BINDER (Германия).

3.Центрифуга Beckman.

4.Культуральные планшеты с 96 ячейками, пипетки,

5.Раствор 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,50- дифенилтетразолбромида.

6.ФЭК.

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА 3.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНТЕНСИВНОСТИ КЛЕТОЧНОЙ ПРОЛИФЕРАЦИИ В ММТ ТЕСТЕ

Задание на выполнение лабораторной работы

Порядок выполнения работы:

1.Приготовить раствор 5 мг/мл МТТ, растворенного в PBS, и стерилизуйте его через фильтр.

2.За 5 часов до окончания инкубации добавить раствора МТТ (1 мл раствор паро-нитрофенолфосфата в концентрации 16 мМ/л и выдерживали 2 минуты (использовали «Diagnostic kit 245», Sigma). Образующийся под воздействием щелочной фосфатазы паро-нитрофенол, окрашенный в щелочной среде в желтый цвет) в каждую ячейку планшета, содержащую клетки.

3.Инкубировать планшеты в термостате с СО2 при 37°С в течение 5 ч.

4.Удалить среду с помощью иголки и шприца.

5.Добавить по 200 мкл DMSO в каждую ячейку и осторожно перемешайте с помощью пипетки, чтобы растворить кристаллы.

6.Инкубировать клетки при 37°С в течение 5 мин.

7.Перенести на считывающее устройство фотокалориметра и измерьте поглощение при длине волны 550 нм, используя калибровочную кривую.

Если используются более крупные планшеты с большим количеством ячеек, измените объемы в соответствии с числом ячеек.

Контрольные вопросы

1.Принцип метода определения пролиферативногй активности клеток

втесте ММТ?

2.Какие клеточные макромолекулы взаимодействуют с 3-(4,5- диметилтиазол-2-ил)-2,50-дифенилтетразолбромидом?

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА3.10. ТЕХНИКАВЫДЕЛЕНИЯМСКИЗКОСТНОГОМОЗГАКРЫС

Цель лабораторной работы

•обучение технике выделения мезенхимальных стволовых клеток костоного мозга (МСК) и получения первичной культуры.

Материалы и оборудование

1.Половозрелая крыса линии Вистар, масса около 200 г.

2.Реагенты: диэтиловый эфир, этанол, среда Дульбекко (DMEM), (ЭТС), антибиотики, трипсин.

3.Стерильная пластиковая и стеклянная посуда, пипетки.

4.Термостат BD-115, BINDER, СО2-инкубатор Innova CO-48.

5.Бокс-ламинар Logic (LABCONCO, USA).

6.Центрифуга настольная Eppendorf 5810 R

Задание на выполнение лабораторной работы

Порядок выполнения работы:

1.Умертвить животное диэтиловым эфиром.

2.Выделить бедренную кость, зачистить от мягких тканей и обмыть в среде Дульбекко (DMEM), содержащей 1000 Ед/мл пенициллина и 1000 Ед/мл стретомицина.

3.Срезать метафизальные концы кости и на холоду шприцем вымыть столбик костного мозга в стерильную чашку Петри, используя 5 мл первичной среды DMEM, содержащей 20 % эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стретомицина.

4.Разбить столбик на клеточные агрегаты (гемопоэтические островки) шприцем с толстой иглой и разлить в центрифужные пробирки.

5.Костно-мозговой аспират центрифугировать при 400 g 10 минут.

6.Клеточный осадок ресуспендировать в первичной среде и перенести

вT-75 культуральные флаконы, которые поместить в СО2-инкубатор.

7.Клетки инкубировать в гумидной среде при 5% CO2 при 37 oC.

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА 3.10. ТЕХНИКА ВЫДЕЛЕНИЯ МСК ИЗ КОСТНОГО МОЗГА КРЫС

8. После первого пассажа первичную среду заменить полной средой, содержащей DMEM с 20% ЭТС, 100 Ед/мл пенициллина и 100 Ед/мл стретомицина, 10 мМβ -глицерофосфата, 50 г/мл L-аскорбиновой кислоты и 10 нМ дексаметазона, который добавляют для стимулирования образования остеобластов из стромальных клеток.

9 Среду менять на свежую ежедневно стандартной процедурой. Монослой трипсинизировать (0,25 % трипсин и 0,02% EDTA). Клеточную суспензию разводить полной средой до концентрации 1 х 106 клеток/мл и использовать для дальнейших исследований.

Контрольные вопросы

1.Почему наиболее приемлемым источником для получения клеток остеобластического ряда служат МСК костного мозга?

2.Какие ростовые факторы должна содержать основная ростовая среда для стимулирования клеточной дифференцировки в клетки остеобластического ряда?

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА3.11. ОЦЕНКАПРИКРЕПЛЕНИЯКЛЕТОКИРАСПРЕДЕЛЕНИЯКЛЕТОКНА МАТЕРИАЛАХСПОМОЩЬЮЭЛЕКТРОННОГОРАСТРОВОГОМИКРОСКОПА(РЭМ)

Материалы и оборудование

1.Суспензия клеток, выращенная на предыдущей работе.

2.Растровый электронный микроскоп, оборудование и реагенты для фиксации клеток и напыления.

Задание на выполнение лабораторной работы

Порядок выполнения работы:

1.Вырастите клетки в культуральных флаконах.

2.Для получения клеточной суспензии надо следовать протоколу по субкультивированию клеток.

3.Сосчитать клетки, пользуясь протоколом окраски трипановым синим (как описано выше).

4.Определить плотность клеток, необходимую для посева на материа-

лах.

5.Высевать клетки и дайте возможность им вырасти в течение необходимого периода времени.

6.Не капать и не наливать растворы поверх клеток (существует очень большая вероятность смыва клеток)!!!

7.Дважды промыть клетки PBS.

8.Закрепить клетки на поверхности 2,5%-ным глутаровым альдегидом

вPBS в течение 40 мин при 4°С.

9.Дважды промыть клетки PBS.

10.Обезвоживать этанолом в возрастающей концентрации.

а) 25% – 5 мин; б) 50% – 5 мин; в) 70% – 5 мин; г) 90% – 5 мин; д) 100% – 5 мин; е) 100% – 5 мин.

11. Инкубировать клетки с гексаметилсилазаном (HMDS) в тече ние

5мин.

12.Инкубировать клетки со свежим HMDS в течение 5 мин.

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА 3.11. ОЦЕНКА ПРИКРЕПЛЕНИЯ КЛЕТОК И РАСПРЕДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК НА МАТЕРИАЛАХ

13.Напылить на образцы коллоидный раствор золота.

14.Рассмотреть приготовленные образцы пролиферирующих клеток на матриксах в сканирующем электронным микроскопом (рис. 3.27).

Рис. 3.27. РЭМ снимки фибробластов мыши, пролиферирующих на полимерных матриксах из ПГА разных типов:

а и б – пленочные матриксы с гладкой и шероховатой поверхностью; в – прес-

сованный объемный матрикс; г – ультратонкие волокна, полученные методом ЭСФ (материалы Е. И. Шишацкой Е. И. и Е. Д. Николаевой)

Контрольные вопросы

1.Какие характеристики клеток выявляются с помощью световой и электронной микроскопии?

2.Почему электронная микроскопия стала неотъемлемым методом в ходе ведения и изучения клеточных культур?