Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Большой практикум / Белки и ДНК / Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум.pdf
Скачиваний:
8
Добавлен:
09.05.2021
Размер:
12.3 Mб
Скачать

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ. Технология микроклонального размножения растений

Цель работ раздела

практическое освоение способов культивирования растений in vitro: метод апикальной меристемы; получение каллусов, суспензий и растений-регенерантов на диплоидном уровне.

Задачи раздела

ознакомление с видами и способами выделения эксплантов для проведения микроклонального размножения;

освоение техники этапов и способов микроклонального размножения;

определение роли фитогормонов в процессе микроразмножения на разных его этапах;

управление возможностями увеличения коэффициента размножения растений.

Объекты исследования: декоративные и сельскохозяйственные растения.

Краткие теоретические сведения

Достижения в области культуры клеток и тканей привели к созданию принципиально нового метода вегетативного размножения растений – клонального микроразмножения (получение в условиях in vitro, неполовым путем растений, генетически идентичных исходному экземпляру). В основе метода лежит уникальная способность растительной клетки реализовывать присущую ей тотипотентность (свойство соматических клеток растений полностью реализовать свой генетический потенциал развития с образованием целого организма), то есть под влиянием экзогенных воздействий давать начало целому растительному организму.

Процесс клонального микроразмножения состоит из следющих этапов:

1 – выбор растения-донора, изолирование эксплантов (ткань, взятая из своего оригинального места и перенесенная в искусственную среду для

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум.Учебебное пособие

177

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

роста и поддержания ее жизнедеятельности) и получение хорошо растущей стерильной культуры;

2 – собственно микроразмножение, когда достигается получение максимального количества микропобегов (или мериклонов – клон*, полученный из меристемной культуры);

3 – укоренение размноженных побегов с последующей адаптацией их к почвенным условиям, а при необходимости депонирование расте- ний-регенерантов при пониженной температуре (2–10 оС);

4 – выращивание растений в условиях теплицы и подготовка их к реализации или посадке в поле.

Клон — популяция клеток, возникших из одной клетки посредством митоза или группа растений, развившихся вегетативным или бесполым путем, все члены которой произошли из одной повторно культивируемой клетки.

Для культивирования тканей на каждом из четырех этапов требуется применение определенного состава питательной среды.

На 1-м этапе (введение в культуру) необходимо добиться получения хорошо растущей стерильной культуры, что осуществляется путем стерилизации растительных тканей, их тщательной промывки в стерильной дистиллированной воде и перенесения на приготовленную стерильную питательную среду. На этом этапе, как правило, используют среду, содержащую минеральные соли по рецепту Мурасиге и Скуга (MS) (табл. 4.1), а также различные биологически активные вещества и стимуляторы роста: ауксины (производные индола, образующиеся в апикальных меристемах и стимулирующие клеточное растяжение) и цитокинины (производные 6-аминопурина, индуцирующие в присутствии ауксина деление клеток и дифференцировку стеблевых почек у каллусов, активирующие рост клеток листа) в различных сочетаниях в зависимости от объекта (работа 4.1).

Продолжительность первого этапа может колебаться от 1 до 2 мес., в результате которого наблюдаются рост меристематических тканей и формирование первичных побегов.

На 2-м этапе (собственно размножение, субкультивирование) необходимо получить максимальное количество микропобегов. Как и на 1-м этапе, используют питательную среду по рецепту Мурасиге и Скуга. Основную роль при подборе оптимальных условий культивирования эксплантов играют со-

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

178

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

отношение и концентрация внесенных в питательную среду цитокининов и ауксинов. Из цитокининов наиболее часто используют БАП в концентрациях от 1 до 10 мг/л, а из ауксинов – ИУК и НУК в концентрациях до 0,5 мг/л.

Наиболее трудоемкими являются 3-й и 4 -й этапы, от которых зависит успех клонального микроразмножения.

На 3-м этапе (укоренение), как правило, меняют основной состав среды: уменьшают в 2, а иногда и в 4 раза концентрацию минеральных солей по рецепту Мурасиге и Скуга или заменяют ее средой Уайта (табл. 4.1), уменьшают количество сахара до 0,5-1 % и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь ауксин. В качестве стимулятора корнеобразования используют β-индолил-3-масляную кислоту (ИМК), α-нафтил-уксусную кислоту (НУК) и чаще и β -индолил-уксусную (ИУК). В последнее время предложен метод укоренения пробирочных растений – в условиях гидропоники (выращивание растений без почвы на искусственных средах с использованием питательного раствора). Он позволяет значительно упростить этап укоренения и одновременно получать растения, адаптированные к естественным условиям.

Затенение нижней части культуральных сосудов плотной черной материей или добавлением в питательную среду активированного угля способствует укоренению микропобегов.

4-й этап (адаптация к грунту). Пересадка растений-регенерантов в субстрат является ответственным этапом, завершающим процесс клонального микроразмножения. Наиболее благоприятное время для пересадки пробирочных растений – весна или начало лета. Растения с 2–5 листьями и хорошо развитой корневой системой осторожно вынимают из колб или пробирок пинцетом с длинными концами или специальным крючком. Корни отмывают от остатков агара и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85–90 °С в течение 1-2 ч. Для большинства растений в качестве субстратов используют торф, песок (3:1), торф, дерновую почву, перлит (измельченная горная порода вулканического происхождения) (1:1:1), торф, песок, перлит (1:1:1). Исключение составляют орхидные, для которых готовят субстрат, состоящий из сфагнового мха, смеси торфа, листьев бука или дуба, сосновой коры (1:1:1). Приготовленным заранее почвенным субстратом заполняют пикировочные ящики или торфяные горшочки, в которых выращивают растения-регенеранты. Горшочки с растениями помещают в теплицы с регулируемым температурным режимом (20–22 °С), освещенностью (не более 5 тыс. лк) и влажностью (65–90 %).

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

179

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

 

 

 

 

 

 

 

Таблица 4.1

 

Составы наиболее употребляемых питательных сред

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Составные компоненты

 

Концентрация компонентов в среде, мг/л

 

 

 

Уайта

MS

 

B5

Нича

N6 (Chu)

 

 

 

 

 

 

 

 

Неорганические вещества

 

 

 

 

 

NH4N03

 

-

1650

 

-

720

-

 

 

KNO3

 

80

1900

 

2500

950

2830

 

 

СаС12х2Н20

 

-

440

 

150

-

166

 

 

СаС12

 

-

-

 

-

166

-

 

 

MgSO4х7 H20

 

750

370

 

250

185

185

 

 

КН2РО4

 

-

170

 

-

68

400

 

 

(NH4)2SO4

 

-

-

 

134

-

463

 

 

Ca(NO3)2х4 H20

 

300

-

 

-

-

-

 

 

Na2 SO4

 

200

-

 

-

-

-

 

 

NaH2PO4хH20

 

19

-

 

150

-

-

 

 

KC1

 

65

-

 

-

-

-

 

 

KI

 

0,75

0,83

 

0,75

-

0,8

 

 

H3BO3

 

1,5

6,2

 

3

10

1,6

 

 

MnSO4х4 H20

 

5

22,3

 

-

25

-

 

 

MnSO4х H20

 

-

-

 

10

-

3,3

 

 

ZnSO4х7 H20

 

3

8,6

 

2

10

1,5

 

 

NaMoO4х2 H20

 

-

0,25

 

0,25

0,25

-

 

 

MoO3

 

0,001

-

 

-

-

-

 

 

CuS04х5H20

 

0,01

0,025

 

0,025

0,025

-

 

 

CoCl2х6H20

 

-

0,025

 

0,025

-

-

 

 

Fe(SO4)3

 

2,5

-

 

-

-

-

 

 

FeSO4х7 H20

 

-

27,8

 

27,8

27,8

27,8

 

 

2ЭДТАх2 H20

 

-

37,3

 

37,3

37,3

37,3

 

 

 

 

Органические вещества

 

 

 

 

 

Никотиновая кислота

 

0,5

0,5

 

1

5

0,5

 

 

Пиридоксин гидрохлорид

 

0,01

0,5

 

1

0,5

0,5

 

 

Тиамин гидрохлорид

 

0,01

0,1

 

10

0,5

1

 

 

Биотин

 

-

-

 

-

0,05

-

 

 

Инозит

 

-

100

 

100

100

-

 

 

Глицин

 

3

2

 

-

2

-

 

 

Фолиевая кислота

 

-

-

 

-

0,5

-

 

 

Сахароза

 

20000

30000

 

20000

20000

50000

 

 

pH

 

-

5,8

 

5,5

-

5,8

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

180

 

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

Через 20–30 дней после посадки, хорошо укоренившиеся растения подкармливают растворами минеральных солей Кнудсона, Мурасиге и Скуга, Чеснокова, Кнопа (в зависимости от вида растений) или комплексным минеральным удобрением. По мере роста растений их рассаживают в большие емкости со свежим субстратом. Дальнейшее выращивание акклиматизированных растений соответствует принятой агротехнике выращивания для каждого индивидуального вида растений.

Культивирование изолированных тканей растений на всех этапах происходит на свету. Освещенность факторостатной (световой) комнаты, где культивирование проводится в пробирках или других сосудах, должна составлять в зависимости от культуры 1000-10000 лк. Необходимо учитывать фотопериод, который требуется для данного культивируемого объекта.

Влажность в световой комнате должна быть 60–70 %. Более сухой воздух способствует усыханию питательной среды в пробирках и колбах, особенно если они закрыты ватными пробками, изменению ее концентрации, а значит, и нарушению условий культивирования. Для повышения влажности в комнате можно использовать поддоны с водой.

Оптимальная температура для большинства культивируемых тканей – 25–26 °С, для культуры тканей тропических растений – 29–30 °С. В случае и н- дукции морфогенеза температуру понижают до 18–20 °С.

Световой и температурный режимы, как и остальные условия, зависят от выполняемых задач. Наилучшие их параметры, а также режим оптимальной влажности можно создать с помощью климатических камер.

Существует несколько способов клонального микроразмножения. Различные авторы, проводя индивидуальные исследования по влиянию условий культивирования эксплантов на процессы морфогенеза, наблюдали разные ответные морфогенетические реакции на изменение условий выращивания, что, в свою очередь, привело к созданию новых классификаций методов клонального микроразмножения.

Исходя из предложенных в литературе путей микроразмножения растений этот процесс можно осуществлять следующими четырьмя методами:

активацией развития уже существующих в растении меристем (образовательная ткань растений, долго сохраняющая способность к делению и возникновению новых клеток, отличается высокой метаболической активностью);

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

181

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

индукцией возникновения адвентивных почек (развитие почек из необычных точек происхождения, например, почечные или корневые ткани, возникающие из каллуса, или зародыши, развивающиеся из других источников, а не из зигот) непосредственно на тканях экспланта;

индукцией соматического эмбриогенеза (образование эмбриоидов- зародышеподобных структур, возникающих путем соматического эмбриогенеза в культурах клеток и тканей, напоминающим нормальный зиготический эмбриогенез);

дифференциацией адвентивных почек в первичной и пересадочной каллусной ткани (неорганизованная, пролиферирующая масса дедифференцированных растительных клеток).

Соматический эмбриогенез возможно наблюдать непосредственно в тканях первичного экспланта, а также в каллусной культуре. Причем последний способ менее пригоден при клональном микроразмножении, так как посадочный материал, полученный таким методом, может быть генетически нестабилен по отношению к растению-донору. Основное отличие образования зародышей in vitro (в стекле) от in vivo (в естественных условиях) заключается в том, что соматические зародыши развиваются асексуально вне зародышевого мешка и по своему внешнему виду напоминают биполярные структуры, у которых одновременно наблюдается развитие апикальных меристем (недифференцированная ткань, локализованная в пределах верхушки побега или кончика корня, представляющая собой куполоподобную структуру) стебля и корня.

Формирование эмбриоидов в культуре тканей происходит в два этапа. На первом этапе клетки экспланта дифференцируются за счет добавления в питательную среду ауксинов, как правило, 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) и превращаются в эмбриональные клетки. Для формирования эмбриоидов необходимо уменьшать концентрацию ауксина или полностью его исключать из состава питательной среды. Как правило, соматический эмбриогенез происходит при культивировании каллусных клеток в жидкой питательной среде (суспензии) и является наиболее трудоемкой операцией.

Этот метод микроразмножения имеет свои преимущества, связанные с сокращением последнего (третьего) этапа клонального микроразмножения, (требующего подбора специальных условий укоренения и адаптации пробирочных растений), потому что соматические зародыши представляют собой

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

182

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

полностью сформированные растеньица. При использовании соответствующей техники их капсулирования из этих эмбриоидов возможно получать искусственные семена.

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

183

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА4.1. СРАВНЕНИЕЭФФЕКТИВНОСТИРАЗНЫХПОГОРМОНАЛЬНОМУИ МИНЕРАЛЬНОМУСОСТАВУПИТАТЕЛЬНЫХСРЕДПРИКУЛЬТИВИРОВАНИИ ИЗОЛИРОВАННЫХТКАНЕЙРАСТЕНИЙ

Цель лабораторной работы

освоение приемов проведения 1-го этапа микроразмножения в культуре изолированных тканей

Краткие теоретические сведения

Культура изолированных зародышей используется в экспериментах для доращивания зародышей, обреченных на гибель в естественных условиях: при проращивании недозрелых семян, для снятия периода их покоя, в исследованиях по отдаленной гибридизации; для проращивания гаплоидных (имеющих один набор хромосом) зародышей культурного ячменя и т. п. Во многих комбинациях межвидовых и межродовых скрещиваний гибридные зародыши гибнут на ранних стадиях развития, поэтому их необходимо своевременно вычленять из семян и проращивать на искусственной питательной среде для сохранения ценных генотипов.

Зародыши эффективнее проращивать на агаризованной, а не на жидкой среде. В качестве питательных сред для зародышей используют среды MS, B5, N6 (табл. 4.1) и другие. Наиболее подходящий энергетический источник – сахароза. Для зародышей злаков и их гибридов используется концентрация сахарозы не менее 30 г/л. В зависимости от степени дифференцированности зародышей используют фитогормональные и другие добавки, в качестве которых применяют цитокинины, ауксины, витамины и аминокислоты.

Материалы и оборудование

1.Зрелые колосья или зерна ячменя или пшеницы, замоченные в воде за 1 сутки до выполнения работы.

2.Пробирки со стерильной питательной средой

3.Стерильные пинцеты, скальпели.

4.Чашки Петри.

5.Стаканы со стерильной водой.

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум.Учебебное пособие

184

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПО ГОРМОНАЛЬНОМУ И МИНЕРАЛЬНОМУСОСТАВУПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Задание на выполнение лабораторной работы

Задание 4.1.1. Определение условий, необходимых для проведения следующихэтапов микроразмножения (формирования проростков иликаллуса вкультуре изолированныхзародышей)

Порядок выполнения работы

1.Зерновки ячменя или пшеницы в обычных условиях предварительно стерилизуют спиртом в течение 2–3 мин, с зародыша снимают защитную пленку, покрывающую зерно. Необходимое для эксперимента количество зерновок одного образца помещают в марлевые упаковки, куда кладут небольшие листки (1 см2) с указанием генотипа донорного растения, и скрепляют их шпагатом.

2.В условиях бокса стерилизуют упаковки в растворе диацида (токсическое вещество) 10 мин, потом трехкратно промывают в стаканах со стерильной водой и переносят в чашки Петри.

3.Пинцетом и скальпелем раскрывают упаковку, раскладывают зерновки на марлю, перевернув их бороздкой вниз и, придерживая пинцетом, скальпелем рассекают (если она не удалена) оболочку и выделяют зародыш, стараясь его не повредить.

4.Зародыш переносят в пробирку с питательной средой, располагая его щитком вниз.

5.Используют три варианта среды:

MS;

MS + 2,4-Д (1 мг/л) и ИУК (2 мг/л );

B5 или N6.

6.Культуральные пробирки закрывают фольгой. На каждой пробирке отмечают дату введения и шифр вводимого в культуру генотипа. Культивирование осуществляют при 22-25 оС, 16-часовом световом дне и освещенности 1000 люкс.

7.Каждая проба (пробирка) должна быть зафиксирована записью в журнале после введения экспланта донорного растения в культуру, а затем при проведении наблюдений и пассажах (перенос или пересадка клеток из

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

185

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПО ГОРМОНАЛЬНОМУ И МИНЕРАЛЬНОМУСОСТАВУПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

одной культуральной емкости в другую) на свежие питательные среды должны быть отражены все изменения.

8.Заполнить табл. 4.2 после окончания манипуляций в ламинар-боксе (первые 4 графы). Количество строк соответствует введенным в культуру эксплантам.

9.В табл. 4.2 после учета характеристик (заражение, нарастание каллусной ткани или появление органогенеза – процесс дифференциации в каллусных клетках, сопровождающийся образованием органов: корней, побегов, de novo) в течение последующего их наблюдения внести изменения в остальные две графы.

Обработка полученных результатов

Разноплановость и разнообразие растительного материала, вводимого в культуру, наличие нескольких этапов культивирования и длительность наблюдений диктуют необходимость строгого учета параметров культивируемых объектов. Поскольку каждый эксплант вводится в отдельную пробирку (сосуд), то эта проба (пробирка) должна быть маркирована после введения экспланта в культуру, а его параметры зафиксированы в учетной записи. Затем при проведении наблюдений и при пассажах должны быть отражены все изменения объектов, произошедшие в период культивирования. Длительность наблюдений каждой пробы до следующей пересадки составляет не более 4-х недель.

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

186

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.1. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗНЫХ ПО ГОРМОНАЛЬНОМУ И МИНЕРАЛЬНОМУСОСТАВУПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

Таблица 4.2

Наблюдение параметров роста культур изолированных тканей растений

экспланта, культуры, генотип

 

 

-во введенных эксплан-

 

Наличие заражения

 

Изменения

 

Результат

№ пробирки

Вариант среды

тов, шт.

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

7

14

21

28

7

14

21

28

дата

вариант

дн.

дн.

дн.

дн.

дн.

дн.

дн.

дн.

 

 

 

 

 

 

 

 

Вид

 

 

Кол

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

При проведении экспериментальных работ по введению тканей растений в культуру и следующих этапов необходимо для каждого задания вносить данные в табл. 4.2 и после учета характеристик в процессе последующего их наблюдения (остальные две графы). В графе «Результат» указывается дата и вариант окончания данного этапа культивирования (следующий пассаж или удаление в связи с заражением, высадка в грунт и т. п.). Количество строк соответствует введенным в культуру эксплантам.

Контрольные вопросы

1.Проанализировать полученные результаты.

2.Сделать выводы по влиянию гормонального состава среды на процессы регенерации в культуре зрелых зародышей.

3.Объяснить, какие условия лучше использовать для проведения дальнейшего микроразмножения.

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

187

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА4.2. ИНДУКЦИЯВОЗНИКНОВЕНИЯАДВЕНТИВНЫХПОЧЕК НЕПОСРЕДСТВЕННОНАТКАНЯХЭКСПЛАНТА

Цель лабораторной работы

дать представление о возможностях второго способа микроразмножения растений и роли фитогормонов в этом процессе

Краткие теоретические сведения

Метод микроклонального размножения основан на способности изолированных частей растения восстанавливать недостающие органы при благоприятных условиях питательной среды и таким образом регенерировать целые растения. Практически каждая клетка может стать источником целого растения, и это можно наблюдать в культуре изолированных тканей.

Образования адвентивных почек можно добиться почти из любых органов и тканей растения (изолированного зародыша, листа, стебля, семядолей, чешуек и донца луковицы, сегментов корней и зачатков соцветий). Этот процесс, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином, находящихся в соотношении 10:1 или 100:1. В качестве ауксина в этом случае наиболее часто используют β- индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) или α-нафтилуксусную кислоту (НУК).

Это наиболее распространенный метод микроразмножения высших растений. Им были размножены многие луковичные цветочные растения (нарциссы, лилии, гиацинты, гладиолусы, тюльпаны) из луковичной чешуи, сегментов базальной части донца луковиц, эксплантов листьев; представители рода Бразика (капуста цветная, кочанная, брюссельская, листовая, брокколи) – из сегментов гипокотиля (участок стебля проростка семенного растения ниже семядольного узла), котиледона (первый лист зародыша растения в семени), листьев; лук, чеснок – из ткани донца луковиц; салат цикорный – из сегментов листовых пластинок; петуния – из сегментов корней; глоксиния, сенполия, стрепто-карпус, эшинапсус – из сегментов листовых пластинок, а также некоторые представители древесных растений – из изолированных зрелых и незрелых зародышей.

Материалы и оборудование

1. Листья бегонии и сенполии.

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум.Учебебное пособие

188

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.2. ИНДУКЦИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ АДВЕНТИВНЫХ ПОЧЕК НЕПОСРЕДСТВЕННО НА ТКАНЯХ ЭКСПЛАНТА

2.Гипохлорит натрия 5-%-й аствор.

3.Пробирки со стерильной питательной средой:

4.– MS;

5.– MS с добавлением:

6.а) 6-БАП – 0,4 мг/л и НУК – 0,1 мг/л;

7.б) 6-БАП – 2 мг/л и НУК – 0,05 мг/л.

8.– MS + витамины по прописи Нича (табл. 4.1)+ 6-БАП – 0,4 мг/л + НУК – 0,1 мг/л.

9.Стерильные пинцеты, скальпели, чашки Петри.

10.Стаканы со стерильной водой.

Задание на выполнение лабораторной работы

Задание 4.2.1. Получить растения-регенеранты путем прямого органогенеза убегонии и сенполиикомнатной фиалки

Порядок выполнения работы

1.Срезают молодые, полностью развернувшиеся листья с черешками с растения, выращенного в комнатных условиях.

2.Листья дезинфицируют с помощью раствора гипохлорита натрия 5,25

%в течение 10 мин.

3.Трижды ополаскивают стерильной водой и переносят в стерильные чашки Петри.

4.Листья разрезают на фрагменты площадью 5 мм2 и пинцетом помещают их в пробирки проксимальной (расположенной ближе к центру тела или к его медианной плоскости) стороной вниз на поверхность агаризованной среды.

5.Листья бегонии высаживают на среду MS и MS, содержащую добавки витаминов по прописи Нича, и фитогормоны – 6-БАП – 0,4 мг/л и НУК – 0,1 мг/л.

6.Листья сенполии на среду MS с добавлением:

а) 6-БАП – 0,4 мг/л и НУК – 0,1 мг/л; б) 6-БАП – 2 мг/л и НУК – 0,05 мг/л.

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

189

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.2. ИНДУКЦИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ АДВЕНТИВНЫХ ПОЧЕК НЕПОСРЕДСТВЕННО НА ТКАНЯХ ЭКСПЛАНТА

Культивирование осуществляют при 22-25 оС, 16 ч-часовом световом дне и освещенности 1000 люкс.

Придаточные побеги образуются без формирования каллуса прямо из экспланта примерно через 4 недели. По окончании 4–6 недель делят каждую культуру, где образовались добавочные побеги, и ее фрагменты (отдельные побеги) переносят на среду того же состава. Эту процедуру повторяют до получения необходимого числа побегов.

Укореняют побеги, пересаживая их каждый по отдельности на агаризованную среду MS, содержащую НУК – 0,1 мг/л. Укоренившиеся побеги пересаживают в почву.

Обработка полученных результатов

1.Оформить табл. 4.2 (лабораторная работа 4.1) и заполнить ее после окончания манипуляций в ламинар-боксе (первые 4 графы). Количество строк должно соответствовать введенным в культуру эксплантам. Каждая проба (пробирка) должна быть зафиксирована после введения экспланта (отметить его размер) в культуру.

2.По прошествии 1, 2…4-х недель в таблицу вносят данные об измен е- ниях, произошедших в пробирках (заражение, изменение цвета и размеров экспланта, нарастание каллусной ткани или появление органогенеза), заполняя остальные две графы.

Контрольные вопросы

1.Проанализировать полученные результаты и сделать выводы по влиянию гормонального состава среды на процессы индукции возникновения адвентивных почек и развития из них побегов бегонии и сенполии.

2.Объяснить, какие условия лучше использовать для проведения микроразмножения декоративных культур.

3.Объяснить, зачем нужны изменения гормонального состава среды при пересадке культур.

4.Рассчитать возможный коэффициент микроразмножения комнатных растений.

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

190

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕПОСАДОЧНОГОМАТЕРИАЛАВКУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХМЕРИСТЕМ

Цель лабораторной работы

ознакомление с основным способом клонального микроразмножения растений и путями его использования

Задачи лабораторной работы:

провести выделение апикальных почечных меристем (недифференцированная ткань, локализованная в пределах верхушечной почки, представляющаяся обычно в виде блестящей куполоподобной структуры – дистальной к самому молодому листовому примордию и размером, менее чем 0,1 мм в длину при вырезании) картофеля и осуществить введение их в культуру;

получить представление о следующих этапах микроразмножения на примере микрочеренкования пробирочных растений картофеля и дальнейшей их адаптации к грунту.

Краткие теоретические сведения

Активация развития уже существующих в растении меристем – это основной метод клонального микроразмножения растений. Главное направление его использования – получение генетически однородного, безвирусного посадочного материала путем введения в культуру меристемных тканей апексов (верхушка побега и корня, состоящая из первичной меристемы, обеспечивающей формирование всех частей и первичных тканей побега) и пазушных почек органов стеблевого происхождения.

Предположение о возможности отсутствия вирусов в меристематических тканях растений впервые высказано Чуигом в 1938 г. и Уайтом в 1943 г. Начиная с 50-х гг. были предприняты первые успешные опыты по получению свободных от вирусов растений георгина из точки роста. Авторы этого метода Морель и Мартин полагали, что в больном растении вирус распространяется с отставанием от быстрорастущих молодых органов, особенно в молодых недифференцированных тканях, где концентрация вируса может снижаться, вплоть до полного отсутствия. Теоретические концепции, положенные в основу этого метода, стали проясняться в последнее время.

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум.Учебебное пособие

191

Рис. 4.1. Схема мест формирования растительных меристем на побеге: верхушечные – 1, боковые – 2, промежуточные – 3

РАЗДЕЛ 4. КУЛЬТУРА РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК И ТКАНЕЙ

РАБОТА 4.3. ОЗДОРОВЛЕНИЕ ПОСАДОЧНОГО МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ АПИКАЛЬНЫХ МЕРИСТЕМ

Строение точки роста растений имеет свою специфику: дистальная ее часть, представленная апикальной меристемой, которая состоит из конуса нарастания, а также одного или двух листовых зачатков (примордий – первый, первичный зачаточный лист) (рис. 4.1). У разных растений средний диаметр до 200 мкм, высота от 20 до 150 мкм. В более низких слоях дифференцирующиеся клетки меристемы образуют прокамбий, дающий начало пучкам проводящей системы.

Известно, что успех клонального микроразмножения зависит от размера меристематического экспланта: чем больше листовых зачатков и тканей стебля, тем легче идет процесс морфогенеза, заканчивающийся получением целого нормального пробирочного растения. С другой стороны, чем больше размер выделяемого экспланта, тем больше вероятность присутствия в нем вируса. Вместе с тем зона, свободная от вирусов, различна для вирусов и зависит также от вида и сорта растения. В колеоптиле (влагалищный, первый лист злаков, в отличие от настоящих, он не имеет листовой пластинки и представляет собой замкнутую трубку, в которую заключены листовые зачатки и ко-

нус нарастания) злаков, например, размеры участка верхушки, не содержащей сосуды, могут достигать до 250 мкм.

Наиболее часто в нашей стране метод оздоровления посадочного материала в культуре изолированных тканей растений используется для картофеля.

Установлена неодинаковая эффективность при оздоровлении различных сортов картофеля от вирусов и даже штаммов одного вируса. Меристемы большего размера свободны от вируса скручивания листьев картофеля, Y- и A-вирусов, наименьшего – от M, X и S-вирусов. Оздоровить картофель от последних наиболее трудно.

В числе многочисленных болезней картофеля особое место занимают вирусные, вироидные и микоплазменные. Большинство из них способно передаваться через клубни, которые в случае заражения становятся резервато-

Современные аппаратура и методы исследования биологических систем. Большой практикум. Учебебное пособие

192

Тут вы можете оставить комментарий к выбранному абзацу или сообщить об ошибке.

Оставленные комментарии видны всем.