РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.5. ОЦЕНКА ЧИСЛЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ВОДЕ МЕТОДОМ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

Рис. 7.7. Люминесцентный микроскоп Axioskop 40 (CarlZeiss, Германия) (А) и получаемое с его помощью изображение бактерий, меченных зондом DAPI (Б) (материалы Е. Немцевой)

Задание на выполнение лабораторной работы

Задание 7.5.1. Оценить численность микроорганизмов в водных образцах

Порядок выполнения работы

1. Подготовка стерильной воды для промывки фильтров.

Чистую стеклянную склянку ополоснуть дистиллированной водой, налить 150–200 мл дистиллированной воды. Приготовить стерильную колбу с пробкой. Набрать чистым пластиковым шприцом воду из склянки. Вскрыть упаковку со стерильной фильтрующей насадкой, не касаясь руками фильтрующей насадки. Присоединить носик шприца к белому входу фильтрующей насадки. Плавно давя на поршень, профильтровать воду через насадку в колбу. Отсоединить шприц, оставив насадку лежать на горлышке колбы. Набрать еще воды в шприц и повторять процесс фильтрации несколько раз, до получения необходимого количества стерильной воды. Закрыть колбу чистой пробкой. Положить насадку обратно в упаковку нижней стороной вниз, аккуратно держа насадку двумя пальцами за диск и не касаясь ничем выходного отверстия.

2. Подготовка предметных и покровных стекол.

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.5. ОЦЕНКА ЧИСЛЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ВОДЕ МЕТОДОМ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

Вытащить из склянки со спиртом два предметных стекла и три-четыре покровных. Промыть стекла под краном и насухо вытереть чистой салфеткой.

3. Проверка работоспособности установки для фильтрации.

Присоединить шланг насоса к боковому выходу колбы Бунзена. Включить насос. Приложить ладонь на несколько секунд к горлышку колбы Бунзена. Если вы почувствуете эффект легкого присасывания ладони к колбе, значит установка готова к фильтрации. Присасывание не должно быть очень сильным. Отрегулируйте силу присасывания с помощью винтового зажима на отводной трубке. После проверки выключить насос.

4. Фильтрация.

Вставить воронку Зейтца в горлышко колбы Бунзена. Отвинтить резьбовое кольцо и снять верхнюю часть воронки. Взять пинцетом волокнистую подложку и смочить ее водой из-под крана. Положить подложку на место. Взять мембранный фильтр пинцетом за край и аккуратно положить его на подложку, следя за тем, чтобы края фильтра покрывали отверстие воронки по всей окружности. Аккуратно надеть верхнюю часть воронки отверстиями на металлические штифты, следя за тем, чтобы края воронки прижимали фильтр по всей окружности. Надеть и закрутить резьбовое кольцо.

Объем профильтрованной пробы зависит от характера исследуемого объекта. При большом количестве бактерий, как в евтрофных природных водоемах, требуется предварительно разбавлять пробу стерильной профильтрованной водой из этого же водоема в несколько раз (от 2 до 1000). После разбавления фильтруют, как правило, 1 мл разбавленной пробы. При анализе воды с малым количеством бактерий (водопроводная вода, олиготрофные водоемы и т. п.) требуется наоборот, профильтровывать несколько миллилитров, вплоть до нескольких сот. Оптимальный объем определяется для каждого случая экспериментально.

Налить требуемое количество пробы и включить насос. Следить за прохождением пробы через фильтр, не давая фильтру долго оставаться сухим. Пробу добавлять небольшими порциями известного объема, чтобы можно было подсчитать общий объем профильтрованной жидкости. Прохождение анализируемой пробы через фильтр определяется визуально. Дождаться прохождения всего заданного объема через фильтр. Отключить насос.

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.5. ОЦЕНКА ЧИСЛЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ВОДЕ МЕТОДОМ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

5. Подготовка препарата для микроскопии.

Аккуратно отвинтить резьбовое кольцо и снять верхнюю часть воронки, следя за тем, чтобы фильтр остался на нижней части воронки. Взять пинцетом фильтр за край и поместить его на фильтровальную бумагу на несколько минут до высыхания. Аккуратно, держа фильтр за край пинцетом, вырезать ножницами участок из центральной части фильтра приблизительно 5×10 мм. Положить вырезанный участок фильтра на предметное стекло. Набрать 50 мкл раствора DAPI автоматической пипеткой с чистым носиком. Закрыть склянку с раствором DAPI фольгой для защиты от света. Нанести набранное количество DAPI на участок фильтра, не касаясь носиком поверхности. Накрыть перевернутой непрозрачной крышкой предметное стекло с участком фильтра для защиты от света и выдержать в темноте 5 мин. Затем взять участок фильтра пинцетом и мягко промыть в стерильной воде, предварительно налитой в чашку Петри. Положить участок фильтра на фильтровальную бумагу и высушить в течение нескольких минут.

На второе предметное стекло нанести небольшую каплю иммерсионного масла. Аккуратно, держа за край пинцетом, наложить участок фильтра на каплю. Нанести еще одну небольшую каплю масла на участок фильтра. Аккуратно накрыть предметным стеклом. Нанести на покровное стекло небольшую каплю масла. Препарат готов.

Можно приготовить до трех препаратов на одном предметном стекле. Подписать маркером стекло и отдельные препараты.

6. Подготовка препарата чистого фильтра в качестве образца для сравнения.

Взять чистый фильтр пинцетом. Вырезать из него участок, обработать DAPI, промыть и сделать препарат, как описано в п. 5. Получить образец для сравнения.

7. Подготовка микроскопа.

Включить в сеть блок питания ртутной лампы. Плавно вращая ручку реостата выставить ток около 1,5 А. Дожидаться включения ртутной лампы около 10 мин.

Установить светоразделительную пластину марки «Голубая» в гнездо. Установить объектив ×90 и окуляр ×10. Включить лампу накаливания микр о- скопа.

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.5. ОЦЕНКА ЧИСЛЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ВОДЕ МЕТОДОМ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

8. Просмотр и подсчет бактерий.

Опустить предметный столик и поместить на него предметное стекло с готовым препаратом. Заслонка ртутной лампы должна быть закрытой. Плавно приблизить предметный столик к объективу до касания линзой объектива капли масла. Глядя в окуляр и плавно вращая сначала грубый винт, а затем микровинт, добиться изображения фильтра в проходящем свете лампы накаливания. Выключить лампу накаливания и открыть шторку ртутной лампы. С помощью микровинта добиться резкого изображения голубых частиц на темно-синем фоне. Целые клетки бактерий светятся ярко-голубым светом и выглядят в виде характерных для бактерий форм: палочек, кокков, спирилл, вибрионов, цепочек и т. д. По форме их легко отличить от частиц грязи и детрита, которые имеют неправильную форму.

Просмотреть препарат чистого фильтра и убедиться, что бактериальных клеток на нем почти нет (1–2 клетки в поле).

Подсчитать количество бактерий на препаратах исследуемых проб в 20 полях микроскопа и определить среднее количество бактерий в поле для каждой пробы.

После подсчета всех приготовленных препаратов поместить объектмикрометр на место предметного стекла, капнув масла на шкалу. Действуя аналогично случаю с просмотром препаратов, добиться резкого изображения шкалы объект-микрометра в поле микроскопа. Определить диаметр поля, подсчитав число делений объект-микрометра, умещающихся в поле. Цена деления указана на объект-микрометре.

9. Вычисление концентрации бактерий в пробе.

Для каждой пробы оценить концентрацию бактерий по формуле

X = Sф x k , s V

где Sф – площадь фильтрующей поверхности фильтра (оценивается по формуле площади круга, диаметр оценивается с помощью линейки), x – сред-

нее число бактерий в поле зрения, s – площадь поля зрения (оценивается по формуле площади круга, диаметр измеряется с помощью объектмикрометра), k – кратность разведения (если пробу не разводили перед фильтрацией, то k = 1, если разводили в 10 раз, то k = 10 и т. д.), V – объем профильтрованной пробы, в 1 мл.

РАЗДЕЛ 7. ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ

РАБОТА 7.5. ОЦЕНКА ЧИСЛЕННОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ В ВОДЕ МЕТОДОМ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ

Результат выразить в стандартной форме в единицах [Клеток/мл].

Определить среднеквадратичную погрешность средних значений по формуле:

(7.6)

Определить доверительный интервал

∆ x = tα,n S,

где tα,n – коэффициент Стьюдента. Для доверительной вероятности 0.95 и n = 20:

tα,n = 2,1

Результат записать в виде

X =X ± ∆ x

Сделать выводы из сравнения численностей бактерий в исследованных пробах.

Контрольные вопросы

1. Основные принципы микроскопических методов определения численности микроорганизмов:

а) преимущества и недостатки метода посевов; б) преимущества и недостатки метода прямого счета на фильтрах.

2.Основные принципы люминесцентной микроскопии. Устройство люминесцентного микроскопа.

3.Свойства DAPI:

а) химическое строение, полное название;

б) какие физико-химические свойства этого соединения делают его удобными для использования в флуоресцентной микроскопии (назовите минимум 3);

в) механизм взаимодействия DAPI с нуклеиновыми кислотами, белка-

ми;

г) области применения DAPI, какие задачи решаются с его помощью.