РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА 3.5. ПОСУДА И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ РАБОТЫ С КЛЕТОЧНЫМИ КУЛЬТУРАМИ

Таблица 3.2

Примеры широко используемых культуральных сред

Задание на выполнение лабораторной работы

Задание 3.5.1 Приготовление питательной среды

Порядок выполнения работы

1.Перед использованием готовых питательных сред в них следует добавить определенное количество (обычно 5–10%) сыворотки (эмбриональной, крупного рогатого скота и т. д.).

2.Внести ростовые факторы, обеспечивающие диффренцировку исходных клеток в нужном направление (эпидермальные ростовые факторы – EGF, факторы роста фибробластов – FGF, эритропоэтин, интерлейкин-3 – IL-3). Ростовые факторы – это высокоспецифичные белки сыворотки; большинство из них вносится в питательные среды в очень незначительных количествах: 10-9–10-11М. Функцией ростовых факторов является прежде всего стимуляция пролиферации клеток и клеточного метаболизма.

3.В среду обязательно внести антибиотики из расчета на 100 мл): пенициллин 1000000 ед. 20 мкг, гентамицин 1000 ед. 25 мкл.

4.Питательные среды готовятся переливанием в один →флакон→всех составных→ частей в направлении уменьшения объема (DМЕМ ГЛА среда

199 и т. д.).

5. Компоненты составных питательных сред, которые не могут быть стерилизованы в автоклаве или сухожаровом шкафу, необходимо подвергнуть стерилизации фильтрованием.

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА 3.5. ПОСУДА И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ РАБОТЫ С КЛЕТОЧНЫМИ КУЛЬТУРАМИ

6. Внести индикатор. Культуральная клеточная среда имеет красный цвет в результате добавления в среду индикатора фенолового красного. Индикаторы добавляют в питательные среды для того, чтобы контролировать кислотность среды в любой момент выращивания клеток, которые подкисляют среду продуктами обмена, и индикатор приобретает желто-оранжевое окрашивание. В процессе культивирования клеток необходимо следить за степенью прозрачности среды. Замутнение среды или изменение цвета индикатора на ярко-желтый или красно-синий (малиновый) может свидетельствовать о заражении среды и культуры клеток посторонними микроорганизмами.

В ходе культивирования и пересева клеток используют, помимо основных ростовых, антибиотических и индикаторных компонентов,трипсин и версен. Эти реагенты необходимы для дезагрегации монослоя при пересеве клеточной культуры или для выделения клеток из тканей при получении первичных культур. Обычно при пересеве используют раствор трипсин– версена в соотношении 1:1.

Лабораторная посуда и мелкий инструментарий, необходимые для выращивания клеток:

1.Пластиковые планшеты.

2.Чашки Петри.

3.Стеклянные и пластиковые флаконы.

4.Плоскодонные бутыли.

5.Сосуды Карреля.

6.Флаконы для питательных сред различного объема.

7.Пипетки автоматические с пластиковыми одноразовыми наконечни-

ками.

8.Стеклянные мерные пипетки.

9.Пеналы для стерилизации и хранения пипеток.

10.Фильтры, пробки резиновые и ватно-марлевые.

11.Насосы-дозаторы.

12.Шейкеры-инкубаторы.

13.Шпатели.

Вслучае использования стеклянной посуды перед процедурой стерилизации посуда тщательно моется в поверхносто-активными веществами. Для этого используется посудомоечная машина LABCONCO ® фирмы Fiaskscrubber ® (США). После высушивания посуды все отверстия в стеклянной посуде (горлышки бутылей, флаконов, сосудов Карреля) заворачиваются

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА 3.5. ПОСУДА И ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ ДЛЯ РАБОТЫ С КЛЕТОЧНЫМИ КУЛЬТУРАМИ

в двойной слой фольги таким образом, чтобы внешний слой фольги был длиннее внутреннего. Это обеспечивает дополнительную защиту внутренней среды сосуда или флакона. Резиновые пробки, наконечники для автоматических пипеток, фильтродержатели с фильтрами помещаются в стеклянные стаканы, которые также закрываются перед стерилизацией двойным слоем фольги. Манипулирование с посудой, переливание растворов в ходе приготовления сред, пересевы клеток и пр., то есть все процедуры выполняются в работающем боксе-ламинаре таким образом, что горящая спиртовка отделяет рабочую зону от работающего.

Контрольные вопросы

1.Какие компоненты являются обязательными в составе сред для выращивания клеток тканей и органов ?

2.Для чего необходимо вносить в состав питательных сред для клеток антибиотики

3.Какую роль играют в ходе выращивания клеток индикаторные краси-

тели

4.Какую посуду, изготовленную из какого материала, используют для приготовления сред и культивирования клеток?

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА3.6. ПЕРЕСЕВКЛЕТОК. ОКРАСКА, ПОДСЧЕТИФОТОГРАФИРОВАНИЕ КЛЕТОК

Цель лабораторной работы

•обучить основным приемам работы с клеточными культурами in vitro в лаборатории.

Краткие теоретические сведения

Различают два основных типа культуры клеток: первичную культуру и культуру стабильных клеточных линий. Первичные культуры получаются непосредственно из тканей животных и человека и культивируются либо как маленькие кусочки тканей, либо как отдельные клетки, полученные после обработки тканей ферментами, например трипсином и коллагеназой. Главным недостатком первичных культур является то, что они стареют физиологически и клетки утрачивают способность к делению, а также некоторые фенотипические признаки. Главное преимущество первичных культур – в сохранении многих первоначальных характеристик в течение всего ограниченного срока жизни. Стабильные клеточные линии могут поддерживаться в культуре либо в течение ограниченного числа клеточных делений, либо неопределенно долгий срок. Многие из таких линий получают из опухолевых тканей пациентов, при этом некоторые из клеточных линий становятся бессмертными (иммортализованными) при внедрении в клетку онкогенных вирусов. Эти клеточные линии могут продуцировать неограниченное число клеток, но клетки сохраняют очень мало специфичных для ткани характеристик.

Для роста клеток, полученных из твердых тканей, требуется прикрепление к субстрату, в то время как клетки, полученные из крови, растут во взвеси. Клетки во взвеси имеют округлую форму, а клетки, прикрепленные к субстрату, различны по форме в зависимости от происхождения. Как только клетки прикрепятся к субстрату, они начинают делиться и размножаться, образуя плотный непрерывный слой, покрывающий субстрат. Большинство клеток, в особенности первичные клетки, контактируя с соседними клетками, прекращают рост, однако опухолевые клетки обычно имеют тенденцию к трехмерному росту с образованием множества слоев. Клетки в культуре, занимающие 70-80% субстрата, в идеале можно обрабатывать трипсином, и затем пересевать часть клеток в новый флакон со свежей культуральной средой, т.е. получать субкультуры.

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА 3.6. ПЕРЕСЕВ КЛЕТОК. ОКРАСКА, ПОДСЧЕТ И ФОТОГРАФИРОВАНИЕ КЛЕТОК

Материалы и оборудование

1.Флакон со стерильной средой.

2.Образец культуры.

3.Пипетки, шпатели.

4.Культуральные планшеты, флаконы.

5.Спиртовка.

6.Бокс-ламинар.

Задания на выполнение лабораторной работы

Задание 3.6.1.Размораживаниеклеток

Большинство имеющихся в продаже клеток приобретается в замороженном виде. После получения эти замороженные клетки должны незамедлительно переводиться в жидкий азот для хранения. В нижеприведенном протоколе дается описание того, как оживить замороженные клетки, хранящиеся под жидким азотом.

Порядок выполнения работы:

1.Подготовить среду для выращивания клеток.

2.Подогреть среду.

3.Наклеить этикетку на культуральный флакон и на центрифужную пробирку объемом 15 мл.

4.Добавитье 8 мл среды в центрифужную пробирку.

5.Достать ампулу, содержащую клетки, из банка жидкого азота (необходимо надеть термические перчатки и маску).

6.Оставтить ампулу при комнатной температуре около 1 мин, но не

дольше.

7.Перенести ампулу в водяную баню при 37 °С и дать ей оттаивать около 4 мин.

8.Вытереть ампулу салфеткой, смоченной в 70%-ном спирте, и перенести сразу же в ламинарный шкаф.

9.Аккуратно пипеткой внесите клетки в центрифужную пробирку.

10.Промойте ампулу в 1 мл свежей среды и добавьте в пробирку.

11.Осадите клетки в пробирке при 200 х g в течение 5 мин.

12.Удалите надосадочную жидкость, не задевая осадок.

13.Встряхните пробирку для того, чтобы поднять осадок.

РАЗДЕЛ 3. БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ В КУЛЬТУРЕ. МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ ДЛЯ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ

РАБОТА 3.6. ПЕРЕСЕВ КЛЕТОК. ОКРАСКА, ПОДСЧЕТ И ФОТОГРАФИРОВАНИЕ КЛЕТОК

14.Добавьте 1 мл свежей среды и аккуратно суспендируйте клетки пи-

петкой.

15.Добавьте необходимое количество культуральной среды во флакон.

16.Добавьте во флакон со средой суспензию клеток и хорошо пере-

мешайте.

17.Поставьте флакон в термостат.

Когда клетки покроют 70–80% поверхности флакона, их нужно пассировать на материалы или во флаконы со свежей средой. С каждой субкультурой число пассажей растет. Для воспроизводимости эксперимента число пассажей в культуре должно быть одинаковым в различных экспериментах с культурами клеток. Увеличение числа пассажей может привести к фенотипическим изменениям в клетках.

Задание3.6.2. Тестирование состояния клеток иконтаминации

Порядок выполнения работы:

1.Проверить культуральную среду. Если среда мутная, есть вероятность бактериальной инфекции (для прикрепленных на субстрате клеток).

2.Определить число прикрепленных клеток по сравнению с числом плавающих клеток. Плавающие клетки – это, как правило, мертвые клетки.

3.Исследовать морфологию клетки. Как правило (в зависимости от типа клетки), прикрепленные здоровые клетки распластаны и имеют веретеновидную удлиненную форму, иногда с отростками, округлые клетки – это либо делящиеся клетки, либо гибнущие клетки.

4.Ищите гигантские клетки. В большинстве культур частота таких клеток относительно низкая и постоянна при одинаковых условиях культивирования.

5.Определите скорость, с которой клетки прикрепляются и приступают

кделению после пассажа. Прикрепление в течение 1–4 часов свидетельствует о том, что клетки не травмированы.

6.В то время как грибковые и бактериальные инфекции относительно легко обнаруживаются опытными учеными, заражение микоплазмой невидимо и поэтому более трудное для распознавания. Наборы для распознавания микоплазмы имеются в продаже и должны использоваться, если возникают признаки инфекции.