Серодиагностика и ретроспективная диагностика

РН. Диагноз на прошедшую инфекцию обычно ставят при помощи РН в культуре кле­ток, определяя титры ВНА в сыворотках крови реконвалесцентов. Для этого используют по­стоянную дозу вируса (100-1000 ТЦД₅₀) и двукратные разведения испытуемой сыворотки, которую предварительно инактивируют 30 мин при 56°С. Для более точной диагностики лучше исследовать парные сыворотки, взятые с интервалом 3-4 нед. Титры AT у перебо­левших животных могут колебаться от 1:8 до 1:1280. ВНА обычно появляются на 7-8-й день после заражения и циркулируют в крови 18 мес. На 14-й день титр их у свиноматки, 3-дн и 3-нед поросят достигает 1:128 - 1:1024, а у отъемышей и откормочных свиней - 1:32- 1:256, С 3-4 мес титр медленно снижается, через год он уже на 2-3 разведения ниже максимально­го. У некоторых: свиноматок, наоборот, титр AT резко снижается. Колостральные AT обыч­но исчезают у поросят в возрасте 3-4 мес, в связи с чем обнаруженные у животных в это время ВНА следует относить за счет инфекции.

Для выявления и титрования AT предложен микрометод РН с использованием микропланшетов. Сначала готовят двукратные разведения исследуемых сывороток (от 1:4 до 1:256) в объеме 0,05 мл, затем во все лунки микропипеткой вносят по 0,05 мл вируса, со­держащего 100 ТЦД_50. После часовой инкубации при комнатной температуре во все лунки вносят по 0,05 мл суспензии клеток почек или щитовидной железы свиней в концентрации 300 тыс. клеток в 1 мл питательной среды, содержащей 30% инактивированной телячьей сыворотки. Пластины с культурой клеток выдерживают в термостате при 37°С в течение 4 да с 5% СО₂. Контролем РН служат 8 лунок с незараженной культурой клеток. Реакцию учитывают через 48-96 ч при условии наличия ЦПД в лунках, инфицированных вирусом в разведении 10-¹ и 10-², и в лунках, инфицированных смесью вируса с отрицательной сыво­роткой, и при отсутствии ЦПД в лунках, инфицированных смесью вируса со специфической сывороткой, и в лунках, не зараженных вирусом. Положительными считают сыворотки, ко­торые в разведении не ниже 1:4 полностью нейтрализуют 100 ТЦД₅₀ вируса.

Тест нейтрализации бляшкообразования более чувствителен, чем РН, Титр AT в нем ко­леблется от 1:100 до 1:5000, а в РН- 1:10 до 1:160.

РНГА. Используют для определения AT в парных сыворотках крови больных животных, а также для контроля за эпизоотическим состоянием племенных хозяйств-репродукторов в отношении гастроэнтерита. При этом у 5% поголовья 2 раза в год выборочно исследуют сы­воротку крови на наличие AT к вирусу. РНГА ставят в макро - и микровариантах по обще­принятой методике. Положительными считают сыворотки, которые в разведении 1:16 и выше вызывают агглютинацию эритроцитарного диагностикума. РНГА более чувствитель­на, чем PH. AT у заражённых поросят выявляются на 4-й день. РНГА используют как для подтверждения клинического диагноза, так и для выявления скрытых форм болезни и вирусоносительства. Реакция позволяет выявлять антитела к ВИГС в 2 раза чаще, чем РН. В бывшем СССР разработан эритроцитный диагностикум, с помощью которого можно вы­явить специфические AT у вакцинированных и больных ИГС.

ИФ. Описана модификация этого метода, обеспечивающая быстрое выявление и титро­вание AT к ВИГС. Сущность её заключается в приготовлении большого количества тефлонизированных стёклышек с лунками, содержащими АГ ВИГС. Их получают путём посева в лунки смеси инфицированных и неинфицированных клеток перививаемой линии свиньи тестикулов. Стёклышки помещают в чашки Петри, которые инкубируют 16-18 ч в термоста­те с газовой смесью воздуха, содержащей 5% CО₂. Около половины клеток в каждой лунке оказывались инфицированными вирусом, что обеспечивает контрастность, помогающую определить специфическую флюоресценцию в присутствии разной степени фонового окра­шивания. После фиксирования ацетоном стёклышки можно хранить до использования в НИФ при минус 20°С. Сравнение этой модификации с РН, показывает что по чувствитель­ности она не уступает, обладая рядом преимуществ: быстротой получения результатов (3 ч по сравнению с 4-6 дн для РН); простотой постановки; значительно меньшим расходом культуры клеток; возможностью хранения полученных препаратов в замороженном состоя­нии в течение нескольких месяцев. Важным оказалось также то обстоятельство, что токсич­ность исследуемых сывороток, часто существенно осложняющая проверку их в РН, не явля­ется препятствием для получения результатов.

РДП. Позволяет выявлять AT к ВИГС. АГ в данной реакции служит щелочной экстракт содержимого кишечника поросят, зараженных ВИГС.

ELISA. Успешно используется для выявления и количественного определения сыворо­точных AT к ВИГС. При исследовании сывороток от поросят, инокулированных культуральным или кишечным ВИГС, ELISA выявлял AT к вирусу в среднем на 3 дня раньше, чем РН при исследовании проб сывороток от поросят, заражённых культуральным вирусом, и на 1 день раньше при обследовании сывороток от поросят, заражённых кишечным виру­сом, причём титры AT в ELISA превышают титры ВНА. Имеются и другие достоинства ELISA по сравнению с РН, в частности, на результаты реакции не влияет присущая некото­рым полевым сывороткам цитотоксичность. С 1981 г. этот тест в двух вариантах - косвен­ный и послойный (двухсэндвичный) - успешно используется в ветеринарной практике Италии. Интересно, что с его помощью можно количественно оценивать lg 3 классов: G, М и А. Модифицированный авторадиографический тест для выявления AT к вирусу ИГС был предложен в 1983 г. в Чехословакии.

Метод блокирования ELISA. Этот метод используется для дифференциации ВИГС и РКВС с помощью монАТ. В блок-ELISA АГ ВИГС реагирует с сывороткой к ВИГС или монАТ к РКВС.

РТГА. ВИГС обладает ГА активностью в отношении эритроцитов цыплят, морских свинок и КРС, но не агглютинирует эритроциты гусей и мышей. Наиболее высокие титры ГА отмечены при 4°С. Поскольку специфическая антисыворотка к вирусу ингибирует ГА, то для серодиагностики ИГС можно использовать РТГА. Титры гемагглютининов в свиных сыворотках коррелируют с титрами ВНА. РТГА с культуральным вирусным АГ ставят на физиологическом р-ре (рН 7,2) с эритроцитами морской свинки в концентрации 0,6% при температуре смеси 4°С, учёт реакции проводят через 1,5-2 ч. Установлена зависимость ГА активности вируса от его инфекционной активности. Определены оптимальные условия по­становки РТГА для обнаружения AT к вирусу ИГС в сыворотках крови свиней. Показана пригодность ее для исследования полевых материалов - сывороток крови и молока свинома­ток на наличие специфических к ВИГС AT. Выявлена корреляция между уровнем AT, вы­являемых в РТГА, и иммуноферментным методом.

Дифференциальная диагностика. В полиэтиологической структуре вирусных гастро­энтеритов свиней доминируют рота - и коронавирусы, вызывающие диарейный синдром. ИФА даёт возможность проведения широкого эпизоотологического анализа и дифферен­циации указанных болезней.

Лабораторная диагностика ротавирусной диареи свиней

Ротавирусы - важнейшие энтеропатогены неонатального периода животных многих ви­дов, включая свиней. Энтеропатогенность ротавирусов свиней (РВС) подтверждается ш способностью вызывать тяжелые гастроэнтериты и атрофию ворсинок в экспериментальных условиях у поросят-гнотобиотов и поросят, не получавших молозива, в отсутствие других возбудителей, Ротавирусная инфекция свиней (РВИС) наблюдается во всех странах с развитым свиноводством.

Для диагностических исследований отбирают образцы кала или содержимого кишечни­ка при остром заболевании. Наибольшая концентрация РВС отмечается в течение 12-24 ч после начала диареи.

Для выявления РВС используют ряд методов, включая ЭМ, ИЭМ, ИФА, изоляцию, ре­акцию латекс-агглютинации, дот-блот-гибридизации, РНК-электрофоретипирование.

Индикация вируса. ЭМ и ИЭМ. Это основной метод выявления вируса. Он позволяет обнаруживать раз­личные группы РВ. Морфология и тип вирусных частиц, обнаруживаемые в негативно контрастированных препаратах, изменяются при окрашивании и зависят от серогрупп РВС. Не­гативное окрашивание фосфорно-вольфрамовой кислотой (ФВК) при нейтральном рН выяв­ляет предпочтительно 1-слойные капсиды, тогда как ФВК при рН 4,5 или уранилацетат вы­являют 2-слойные частицы. Ядро частиц выявляется у РВС группы В. ИЭМ позволяет дифференцировать различные серогруппы РВС.

ИФА. Часто используется для выявления вирусспецифического АГ в фекалиях или со­держимом кишечника и более чувствителен, чем латекс-агглютинация, но менее чувст­вителен чем ЭМ. Электрофоретипирование вирусной РНК часто используется для обнаружения и дифференциации серогрупп РВС, но эти результаты должны быть подтвер­ждены серологически. Дот-блот-гибридизация используется как альтернатива для индика­ции и идентификации групп РВ и их серотипов.

Выделение вируса. У 90-100% поросят до 5-6-нед возраста можно обнаружить РВ в фекалиях. Продолжительность экскреции вируса, как правило, не превышает 1 нед. Изоляты получены из фекалий в клеточных культурах (клетки МА-104). На различном числе пасса­жей наблюдался типичный ЦПЭ, вирусный АГ обнаруживали в цитоплазме инфицирован-ных клеток в ИФ. Адаптация РВ к клеточным культурам подтверждена также с помощью I методов ЭМ и ИФА.

Серологическая диагностика. Разработан метод гемагглютинации и РТГА с РВС I (шт. S-80). ГА вируса получают при репродукции его в клетках МА-104, предварительно обработанных трипсином. Вирус агглютинирует эритроциты человека типа А, В и О, морской свинки и свиней. Титр РГА с эритроцитами морской свинки равен 1:8 - 1:128. Максималь- ный титр ГА отмечен при инкубации вируса с эритроцитами в течение ночи при 4°С. Титр I АТ к РВ со шт. S-80 в РТГА достигает 1:320 и коррелирует с РН (r~0,66). Серологическая (ретроспективная) диагностика имеет небольшое значение в диагностике РВИС, поскольку АТ широко распространены в стаде. Однако титр АТ и серотип отражают иммунный статус животных. Помимо вышеописанной реакции АТ к РВС могут выявляться в непрямой ИФ. Для этого линию клеток МА-104 заражают одной из групп РВС (А, В или С). После куль­тивирования клетки фиксируют в смеси ацетон-метанол и используют в качестве АГ в не­прямой ИФ. С этой же целью можно использовать криосрезы слизистой оболочки кишечни­ка больных поросят. В непрямой ИФА и РТГА обычно выявляют АТ к групповому АГ. ИФА, комбинированный с типоспецифическими монАТ, используют для определения клас­сов АТ к РВС. ВНА выявляются в реакциях подавления бляшкообразования или по­давления фокусов ИФ.

Лабораторная диагностика болезни Тешена

Болезнь Тешена - вирусная болезнь свиней, характеризующаяся развитием негнойного энцефаломиелита и появлением параличей. Болезнь проявляется клиническими признаками поражения центральной нервной системы (гиперстезия, мышечный тремор, нистагм, опистотонус, тоникоклонические судороги, "ходульная походка", параличи конечностей мышц шеи, глотки). Очень часто данную болезнь свиней описывали под различными самостоя­тельными названиями: полиомиелит лошадей, болезнь Талфана, энцефаломиелит поросят, болезнь Клобука и др. Болезнь Тешена регистрируется во всех странах с развитым свиноводством. Для выделения вируса из ЦНС необходимо отбирать пробы тканей от свиней с нервным синдромом на ранней стадии его проявления. У животных с признаками параличей уже че­рез несколько дней вирус не обнаруживается в ЦНС. Вирус может быть выделен в куль­турах клеток из спинного мозга, коры головного мозга или мозжечка.

Идентификацию ви­руса проводят на основе физико-химических характеристик, ИФ или ИФА. Для выяв­ления АТ широко используется ЕLIЗА. При дифференциальной диагностике следует исключить БА, бешенство, КЧС, отравле­ния хлоридами и соланином. Диагноз на прошедшую инфекцию, а также латентное вирусоносительство ставят на основании определения титров АТ в сыворотках крови реконвалесцентов в РН в культуре клеток почки свиньи с использованием лабораторных штаммов ви­русов болезни Тешена, Талфана и Т-80.

Для ускоренной диагностики болезни, а также выявления концентрации вируса в орга­нах и тканях используют ИФ. В первые 3 дня болезни наблюдают специфическое свече­ние цитоплазмы нейронов всех исследованных отделов ЦНС, клеток межпозвоночных уз­лов, отдельных клеточных элементов селезенки, мезентериальных лимфоузлов, слизистой толстого кишечника. Но начиная с 4 сут свечение в нервных элементах и других тканях рез­ко снижается, а на 5-7-е сут энтеровирусный АГ выявляют лишь в эпителии слизистой ки­шечника. Вот почему для диагностики энзоотического энцефаломиелита свиней кроме тка­ней ( мозжечок, продолговатый и спинной мозг), рекомендуемых инструкцией для ИФ, не­обходимо отбирать и кусочки слизистой ободочной кишки. При прижизненной диагностике и определения у животных вирусоносительства разработан и внедрен в производство пря­мой метод флюоресцирующих АТ в мазках - отпечатках со слизистой прямой кишки и фе­калий. Положительную ИФ в мазках наблюдают в эпителиоцитах и их обломках в течение всей болезни, а у переболевших (вирусоносителей) - до 2 мес.

Лабораторная диагностика репродуктивного и респираторного синдрома свиней

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС, "синее ухо, голубой аборт", эпизоотический поздний аборт свиней) - вирусное контагиозное заболевание главным обра­зом свиноматок, характеризующееся абортами, наличием мертворожденных поросят, преждевременными опоросами или задержкой опороса, респираторными нарушениями, появлением окрашивания кожи ушей и других органов. Регистрируется во многих странах.

Диагноз на РРСС ставят на основании клинико-эпизоотологических данных и результатов лабораторных исследований. Лабораторная диагностика основана на выделении вируса, серологических исследованиях. Для выделения вируса используют сыворотку или плазму крови больных и павших поросят, пробы лёгких, селезёнки, плевральной и перикардиальной жидко­сти. Выделение вируса проводят в культурах альвеолярных макрофагов, полученных от мо­лодых (6-8 нед) СПФ-поросят. Успех голландских учёных и объясняется прежде всего тем, что они использовали эту культуру, в то время как культуры клеток РК-2, РК-15 и К-6 оказа­лись не чувствительными для выделения возбудителя. Идентификацию возбудителя проводят по физико-химическим и серологическим свойствам. Из серологических методов используют вначале непрямой метод ИФ и прямой метод ИФА. В США для идентификации возбудителя использовали РН, разработанную с этим вирусом в университете штата Миннесота, а также ИФ и ИФА, разработанные в национальной лаборатории Аmes в шт. Айова. Во Франции разработан непрямой метод ИФА для обнаружения специфических АТ. Сероконверсия в ди­агностических титрах (1:20 и выше) развивается к 14-му дн после экспериментального инфи­цирования, а к 28-му дн титры антител накапливаются до 1:1280. Разработана методика очистки и концентрирования культурального вируса РРСС, репродуцированного в культуре клеток МАРС-145 и FL. Предварительно вируссодержащая суспензия очищается от балласт­ных белков низкоскоростным центрифугированием, затем концентрируется 2-кратным осаж­дением ПЭГ мол.м. 6000 и очищается высокоскоростным центрифугированием (7000 мин-¹ в течение 6 ч). В градиенте плотности СsС1-сахарозы материал концентрировали в 100 раз. Очистка составляла 96,5%. Все этапы подготовки препаратов контролировали по активности в ИФА. Высокоспецифичные активные препараты АГ вируса РРСС используют для изготов­ления АТ диагностикумов для ИФА. Метод непрямой ИФА более простой и его можно использовать в полевых условиях. Достаточно исследовать из стада 10 проб сывороток, (лучше парных), чтобы с уверенностью поставить лабораторный диагноз.

В РФ разработан твердофазный ИФА, для проведения диагно­стики РРСС, составлены наборы диагностикумов для выявления РРСС и специфических АТ. МонАТ к вирусу РРСС могут быть использованы как для выявления АГ вируса РРСС в патологическом материале, так и для определения АТ в сыворотках крови свиней, так как они дают более специфическую реакцию по сравнению с полиАТ.

При дифференциальной диагностике необходимо исключить вирусные и бактериальные болезни, протекающие с нарушениями в репродуктивных системах, а также отравления. Ис­ключают прежде всего АЧС, КЧС, БА, грипп свиней, ЭМК, парвовирусную болезнь, ТГЭ, лептоспироз и хламидиоз. Характерной особенностью этой болезни является обострение вто­ричных и хронически протекающих инфекций, возбудители которых могут скрытно циркули­ровать в пораженных стадах свиней. Это ещё более усложняет проведение лабораторной дифференциальной диагностики.

Лабораторная диагностика cиндрома "голубой глаз" свиней

Синдром "голубой глаз" свиней (СГГС) болезнь, проявляющаяся кератоконъюнктивитом с голубой окраской роговицы, нарушением нервной системы, снижением репродуктивности, высокой гибелью поросят. Регистрируется во многих странах.

Диагностика основана на клинико-морфологических данных, гисто- и вирусологических исследова­ниях. Для изолирования вируса суспензию из головного мозга, лимфоузлов глотки и легких, подозреваемых особей, инокулируют в первичную культуру клеток почки поросенка (или, перевиваемую культуру клеток РК-15). Монослой каждые 24 ч просматривают для обнару­жения синцития. Специфичность ЦПЭ подтверждают в РГА и гемадсорбции с эритроцита­ми разных животных, а также ЭМ и МФА (последний применяют также для прямого обна­ружения вирусспецифического АГ вируса в клетках срезов органов, замороженных в криостате). Для определения вирусспецифических AT используют РЗГА, РН и ИФА.

Известно, что у свиней помутнение роговицы встречается очень редко, его наблюдают у отдельных животных при травмах, авитаминозе А и экспериментальном заражении ВБА. БА имеет с СГГС сходные клинические признаки, при ней также поражаются ЦНС, легкие, репродуктивные органы, но ВБА индуцирует образование внутриклеточных включений, а главным признаком могут служить аборты. Следует помнить, что помутнение роговицы при естественном течении БА никогда не наблюдается. К тому же ВБА является ДНК-содержащим и имеет много отличий от возбудителя СГГС (например, при инокуляции кро­ликам вызывает энцефалит и гибель).

Синдром "голубой глаз" имеет также сходство с энцефалитом, вызывемым ГА вирусом, но помутнение роговицы при этом отсутствует. ГА-вирус, к тому же, не агглютинирует эритроциты лошади, с трудом культивируется в культурах клеток (за исключением первич­ной почки свиньи), величина его составляет 80-120 нм.

По некоторым признакам СГТС имеет сходство и с другими болезнями, парвовирусной инфекцией (поражаются генитальные органы самок); гриппом (респираторные органы); с болезнями, протекающими с нервным синдромом (классическая чума свиней, энтеровирусная инфекция, колибактериоз и др.). Все эти патологии следует дифференцировать от син­дрома "голубой глаз".

Лабораторная диагностика оспы свиней

Оспа свиней (ОС) - контагиозное заболевание, характеризующееся лихорадкой и пузырьково-пустулезной сыпью, появляющейся на коже и слизистых оболочках. Вызывается или оригинальным эпителиотропным вирусом оспы свиней (ВОС), или вирусами оспы ко­ров и осповакцины. Регистрируется во всех странах.

Диагноз ставят на основании клинико-эпизоотологических и эпидемиологических дан­ных, результатов лабораторных исследований, вирусоскопии, гистологического исследования, постановки биопробы на поросятах, кроликах и телятах (последние реагируют на введение вирусов коровьей оспы и осповакцины).

Выделение вируса

Подготовка материала. Очень важно правильно взять патологический материал для исследования. Его берут не менее чем с 5-10 участков пораженных тканей (везикул, папул и др.). Материал от больных животных, до этого обработанных моющими, дезинфицирующими р-рами, для исследования не пригоден. В лабораторию направляют мазки, сделанные из содержимого везикул больного животного, мазки-отпечатки оспенных поражений кожи, содержимое везикул, целые папулы и пустулы, иссеченные вместе с субэпидермальной тка­нью. Мазки высушивают на воздухе и упаковывают в целлофан. Везикулярную жидкость собирают в капилляры пастеровских пипеток, концы которых осторожно запаивают и помещают в пробирки с резиновыми пробками. Для гистологических исследований папулы и пустулы помещают во флаконы с 50%-ным р-ром глицерина и 10%-ным р-ром формалина. Не консервированный материал доставляют в термосе со льдом в тот же день. Необходимо помнить, что ВОС малоустойчив к теплу и кислой среде. Водный р-р глицерина (4-10%-ный) консервирует вирус в течение 4-5 лет. Лиофилизированный вирус сохраняется актив­ным до 3 лет и более, особенно под вакуумом при низкой температуре. Для выделения ви­руса пробы взятого вируссодержащего материала растирают в ступке или готовят 10%-ную суспензию на физиологическом р-ре. Если материал консервировали глицерином, его пред­варительно отмывают физраствором. Суспензию центрифугируют 15 мин при 2000 мин-¹. Надосадочную жидкость отсасывают, добавляют к ней 500 ЕД/мл пенициллина, 250 мкг/мл стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина, встряхивают и выдерживают 12 ч при 4°С.

Заражение животных. Биопробу ставят на 2-3-мес поросятах. Надосадочную жидкость (0,6 мл) втирают в участки скарифицированной кожи живота. Биопробу считают положи­тельной при образовании по ходу насечек через 6-8 дн характерной узелково-пустулезной сыпи и при обнаружении элементарных телец при микроскопии. Биопробу ставят при неяс­ных симптомах болезни и отрицательных результатах вирусоскопических исследований.

Индикация и идентификация вируса

Вирусоскопия. Свежую папулу протирают ватой, смоченной спиртом, срезают (лучше бритвой) и поверхностью среза делают несколько тонких мазков на предметных стеклах. Мазки подсушивают на воздухе и окрашивают методом серебрения (по Морозову). При ви­русоскопических исследованиях пораженных участков кожи обнаруживают характерное расположение вирионов в виде россыпи. Однако отсутствие вирусных частиц в препарате еще не исключает оспу.

ЭМ. ЭМ пораженных участков кожи больных оспой поросят и обнаружение характер­ных вирусных частиц - один из методов экспресс-диагностики оспы. Для этого требуется всего около 30 мин.

Обнаружение специфических телец-включений. Развитие оспенных поражений в коже больных хорошо прослежено гистологическими исследованиями, результаты которых приведены в табл.108.

Таблица 108 – Результаты гистологических исследований кожи свиньи, больной оспой

Обозначения: (+, ++, +++) - выраженность реакции

(-) - отсутствие реакции или внутриклеточных включений

Диагноз на оспу считают положительным при наличии в гистологических препаратах ацидофильных включений и внутриядерных вакуолей в гиперплазированных кератиноцитах эпидермиса кожи. Цитоплазматические включения при ОС относятся к группе Б, т. е. к включениям, материал которых участвует в репродукции вируса.

Серологическая идентификация. Не разработана. Однако при необходимости воз­можна постановка РДП и более чувствительного теста - противоточного электрофореза.

Дифференциальная диагностика. Болезнь у свиней могут вызвать вирусы ОС, оспы коров, осповакцины и, по данным некоторых исследователей, оспы кур. Дифференциацию возбудителя, вызвавшего оспу у свиней, проводят на КЭ, культурах клеток органов и тканей кроликов или поросятах. Для этого используют 2-х поросят, переболевших оспой (подопыт­ные), и 2-х здоровых (контрольные). Им втирают в скарифицированную кожу по 2 капли растворенной сухой осповакцины. Развитие оспенных поражений у подопытных и кон­трольных животных через 5-8 дн после нанесения вируса осповакцины указывает на нали­чие в хозяйстве оспы, вызванной натуральным ВОС. Отсутствие их у подопытных живот­ных при положительной поствакцинальной реакции у контрольных свидетельствует о нали­чии у свиней оспы коров или осповакцины.

Дифференциацию возбудителей, выделенных от больных свиней с клинической карти­ной оспы, проводят на основании данных, приведенных в табл. 109. Более простым спо­собом дифференцирования этих болезней является заражение кролика путем введения ис­следуемого материала в скарифицированную кожу. ВОС не вызывает у этих животных кож­ной реакции, в то время как вирусы осповакцины и оспы коров ее вызывают. Оба последних вируса можно выделить также путем заражения КЭ и культур клеток. Наличие телец-включений вдоль центральной "просветленной" околоядерной зоны в пораженных эпители­альных клетках является патогномоничным для ВОС.

Оспу у свиней следует дифференцировать от экзантем, появляющихся при авитамино­зах, аллергии и нарушении обмена веществ, энзоотической бронхопневмонии, стрептокок­ковом сепсисе, паратифе, чесотке, лишае, ВБС и везикулярной экзантеме. При экзантемах незаразной этиологии обычно не бывает лихорадки и биопроба отрицательная. Экзантема при чесотке, паратифе и других болезнях протекает без стадийного развития, как при оспе, а из патологического материала выделяют соответствующих возбудителей.

Таблица 109 – Дифференциальная диагностика оспы овец

Обозначения: + наличие репродукции на ХАО; 0 - отсутствие таковой. ИН - инкубационный период; * - при отсут­ствии осложнений; ДБ - длительность болезни; в/к - внутрикожное заражение; в/в - внутривенное заражение.

Примечание. Свиньи оспой от овец и коз обычно не заражаются. Среди указанных вирусов перекрестный им­мунитет образуется только между вирусами оспы коров и осповакцины; ВН ОС - вирус натуральной оспы свиней.

Лабораторная диагностика реовирусная инфекция овец

Инфекционная катаральная лихорадка овец ("синий язык" КЛО) - вирусная трансмис­сивная инфекция, передающаяся кровососущими насекомыми из рода Сulicoides, характери­зующаяся лихорадочным состоянием, воспалительно-некротическими поражениями ротовой полости, особенно языка, пищеварительного тракта, эпителия венчика и основы кожи ко­пыт, а также дегенеративными изменениями скелетных мышц. Регистрируется во многих странах. В Российской Федерации с 1993 г. не­благополучными являются не­которые районы Бурятии.

Диагноз ставят на основании эпизоотологических данных, симптомов болезни, патоморфологических изменений и результатов лабораторных исследований. Для окончательно­го диагноза проводят выделение вируса, его идентификацию и ставят биопробу. Для выде­ления вируса более чувствительны 10-11-дн КЭ, заражаемые на ХАО или внутривенно про­бами испытуемой крови, обработанной ультразвуком. Выделенный вирус идентифицируют в РН, применяя типоспецифические сыворотки. Для быстрого обнаружения вируса рекомен­дуется ИФ в культуре клеток. Показано, что РН по бляшкам более чувствительна, чем РСК и РДП. С помощью РСК удается выявлять АТ в сыворотке крови овец и КРС.

Для выделения вируса КЛО проводят иммобилизацию Сulicoides триэтиламином, которым пропитывают специальные аппликаторы. Через 2-3 мин после воздействия паров пре­парата обездвиженных насекомых микроскопируют и отбирают самок, которых замораживают в жидком азоте. Перед началом проведения вирусологического исследования насекомых размораживают и помещают в среду Игла МЕМ с 10% фетальной сыворотки и антибиотиками, обрабатывают ультразвуком; суспензию осветляют центрифугированием. Для выделения вируса КЛО используют перевиваемую линию клеток С 6/36 , полученную из личинки Аedes оlbapietus. Эта линия высоко чувствительна, пригодна для первичной изоляции вируса КЛО из патологического материала. Линию клеток выращивают при температуре 28°С, создавая оптимальные условия для функционирования РНК-полимеразы вируса. Поскольку в этих условиях ЦПД не проявляется, то его наличие в зараженной суспензии клеток насекомых определяют с помощью ИФ и ИФА. Разработан укороченный метод первичной обработки патологического материла (пулов насекомых). Исследование его в культуре клеток показало высокую чувствительность и пригодность для полевых обследований популяций насекомых на инфицированность вирусом КЛО.

Установлена высокая чувствительность метода выделения вируса в перевиваемой линии культуры клеток ПСКГ в сочетании с методом ИФА. Последний рекомендован для вы­явления АГ вируса блутанга в инфицированных культурах клеток и в суспензии инфициро­ванных комаров Сulicoides variipennis. Высокая чувствительность ИФА позволяет обнару­жить одного инфицированного мокреца в смеси с 92 неинфицированными насекомыми. Разработан непрямой вариант ИФА для серологической диагностики блутанга. Оконча­тельная диагностика КЛО, которая часто протекает субклинически у домашних и диких жи­вотных, может быть проведена только лабораторными методами выделения вируса, выявле­ния АГ, нуклеиновых кислот вируса и АТ. Вирус выделяют из компонентов крови, в основ­ном из эритроцитов, отобранных у животных во время лихорадочной реакции. Исследуемый материал вводят в КЭ и проводят пассаж в культуре клеток (ВНК -21, Vero).

Для идентификации вирусных АГ используют ИФ, РН, ИЭМ с применением монАТ и ИФА. Дня выявления нуклеиновых кислот делают гибридизационный анализ и ПЦР. АТ обнаруживают в РДП в агарозе и в конкурентном ИФА. Последняя реакция с использовани­ем вирусепецифических монАТ является более чувствительным и специфичным методом обнаружения АТ к КЛО. РН в культуре клеток служит наиболее общепринятым методом выявления типоспецифических АТ. Во ВНИИЗЖ также получены монАТ для постанов­ки ингибирования ТФ ИФА.

КЛО необходимо дифференцировать от ящура, контагиозного пустулезного дерматита (эктимы), оспы, везикулярного стоматита, злокачественной катаральной лихорадки, сердеч­ной водянки, болезни Найроби, лихорадки долины Рифт и некробактериоза.

Лабораторная диагностика оспы овец

Оспа овец - острая контагиозная болезнь, протекающая с характерными папулезно-улезными поражениями кожи морды и других мест со слабым волосяным покровом (экзантема) и слизистых оболочек. В 1964 г. на XII сессии Генерального Комитета МЭБ оспу овец внесли в список наиболее опасных (конвенционных) болезней животных. Она широко распространена в соседних странах, занимающихся овцеводством. Эпизодически в результате заноса из неблагополучных соседних стран бывают вспышки в южных регионах России.

Диагноз ставят с учетом эпизоотологических данных, результатов клинического обсле­дования, биопробы и вирусоскопии мазков из свежеразвившихся первичных оча­гов поражения или мест инокуляции вируса при постановке биопробы. В этих случаях необ­ходимо найти животных с характерными оспинами гнездно-сетчатого строения с кратерообразными углублениями, чего при других экземах, как правило, не бывает. При типичном течении диагностировать оспу не трудно. При тщательном обследовании овец пораженной отары всегда можно найти отдельных животных с типичными оспинами на разных стадиях формирования. У одного и того же животного оспины образуются не од­новременно, одни находятся в стадии розеол, другие - в стадии папул.

Лабораторная диагностика оспы основана на выделении вируса, вирусоскопии мазков препаратов из срезанного эпителия розеолы, на присутствие элементарных телец, постановке биопробы, РИФ, РДП.

Выделение вируса. Для исследования берут содержимое везикул или пустул, поверх­ность которых предварительно очищают ватным тампоном, смоченным эфиром или спир­том. Для гистологического исследования вырезают измененные участки кожи на границе с неизмененными. Патологический материал для вирусологических исследований следует пе­ресылать в замороженном или охлажденном (до 4-6°С) виде. Обычно при абортивном и не­ясном течении болезни ставят биопробу на неиммунных молодых овцах. Испытуемую сус­пензию, приготовленную общепринятым методом в разведениях 1:20 и 1:200, инокулируют внутрикожно в бесшерстную поверхность хвоста в дозе 0,1-0,15 мл. Наблюдение ведут в те­чение 10 дн. В положительных случаях на месте инъекции развивается местный оспенный процесс (розеола, папула, везикула, пустула, некроз), специфичность которого подтвержда­ют методом вирусоскопии мазков, приготовленных из срезанного эпителия розеолы, на при­сутствие элементарных частиц.

Серологическая идентификация

ИФ. Исследование (прямой метод) проводят общепринятым методом. При наличии ВОО в клетках инфицированной культуры с 6-8-го ч после заражения в отдельных участках цитоплазмы появляются светящиеся очаги. Позже начинают светиться обширные участки.

РДП. Для получения сыворотки, годной для использования в РДП, иммунизируют кро­ликов овиной, делают 2-4 внутривенные инъекции в объеме 2; 1; 0,5 и 0,25 мл с интервалом в 5 дн. Через 7 дн после последней инъекции у кроликов берут кровь для получения сыво­ротки. Полученные кроличьи сыворотки необходимо истощить культурой фибробластов эм­бриона овцы. РДП ставят общепринятым методом.

Дифференциальная диагностика. Оспу овец и коз в стадии образования пустул и ко­рок следует дифференцировать от чесотки, пустулезной экземы и контагиозного пус­тулезного дерматита (эктимы) овец и коз.

Список сокращений

АЧС – африканская чума свиней

БОЕ – бляшкообразующая единица

БН – болезнь Ньюкасла

ВНА – вируснейтрализующие антитела

ВИЭФ – встречный иммуноэлектрофорез

ВД-БС – вирусная диарея – болезнь слизистых

ВКЧС – вирус классической чумы свиней

ВБА – вирус болезни Ауески

ВЧКРС – вирус чумы крупного рогатого скота

ВБ – вирус бешенства

ВГП – вирус гриппа птиц

ВГС – вирус гриппа свиней

ВЛКРС – вирус лейкоза крупного рогатого скота

ВЯ – вирус ящура

ГАЕ – гемагглютинирующая единица

ЖКТ – желудочно-кишечный тракт

ИФ – иммунофлуоресценция

ИФА – иммуноферментный анализ

ИОЭФ – иммуноэлектроосмофорез

ИГС – инфекционный гастроэнтерит свиней

ИРТ – инфекционный ринотрахеит

ИЛТ – инфекционный ларинготрахеит

КРС – крупный рогатый скот

КЭ – куриный эмбрион

КС – комплемент связывающий

КСА – комплемент связывающие антитела

КЧС – классическая чума свиней

ККРА – кровекапельная реакция агглютинации

КЧП – классическая чума птиц (грипп)

ЛД₅₀ – 50%-ная летальная доза

НРИФ – непрямая реакция иммунофлуоресценции

НИФ – непрямая флуоресценция

РН – реакция нейтрализации

РТГА – реакция торможения гемагглютинации

РП – реакция преципитации

РСК – реакция связывания комплемента

РЗГА – реакция задержки гемагглютинации

РГА – реакция гемагглютинации

РНГА – реакция непрямой гемагглютинации

РПГА – реакция пассивной гемагглютинации

РВИЭОФ – реакция встречного иммуноэлектроосмофореза

РНИФ – реакция непрямой иммунофлуоресценции

РИФ – реакция иммунофлуоресценции

РРГ – реакция радиального гемолиза

РИД – реакция иммунодиффузии

РРСС – респираторный и репродуктивный синдром свиней

СГГС – синдром «голубой глаз»

ТЦД₅₀ – 50%-ная тканевая цитопатическая доза

ТФИФА – твердофазный иммуноферментный анализ

ТГС – трансмиссивный гастроэнтерит свиней

ХАО – хориоалантоисная оболочка

ЦПД – цитопатическое действие

ЦНС – центральная нервная система

ЭФ – электрофорез

ЭЛД₅₀ – 50%-ная эмбриональная летальная доза

ЭМ – электронная микроскопия

Содержание

Общая часть…………………………………………………………………4

Особенности морфологии и строения микроорганизмов………………...4

Формы взаимодействия микро и макроорганизмов……………………..16

Характериные особенности инфекционной болезни……………………18

Методы лабораторных исследований…………………………………….23

Отбор, консервирование, транспортировка и хранение материала для лабораторного исследования………………………………………………….34

Специальная часть…………………………………………………………38

Лабораторная диагностика стафилококкозов.…………………………38

Лабораторная диагностика стрептококкозов………………………………51

Лабораторная диагностика энтеробактерий……………………………….70

Лабораторная диагностика колибактериоза………………..……………...96

Лабораторная диагностика сальмонеллезов……………………………...108

Лабораторная диагностика иерсинеозов………………………………….129

Лабораторная диагностика морганелл……………………………………148

Лабораторная диагностика клебсиелл……………………………………156

Лабораторная диагностика протеи………………………………………..162

Лабораторная диагностика сибирской язвы……………………………...166

Лабораторная диагностика туберкулеза………………………………….178

Лабораторная диагностика паратуберкулеза……………………………..198

Лабораторная диагностика листериоза..………………………………….201

Лабораторная диагностика рожи свиней…………………………………213

Лабораторная диагностика лептоспироза………………………………...217

Лабораторная диагностика клостридиозов…...…………………………..232

Лабораторная диагностика инфекционной энтеротоксемии животных..233

Лабораторная диагностика брадзота овец………………………………..239

Лабораторная диагностика клостридиоза птиц…………………………..242

Лабораторная диагностика эмфизематозного карбункла……………......243

Лабораторная диагностика злокачественного отека……………………..246

Лабораторная диагностика ботулизма……………………………………249

Лабораторная диагностика столбняка………………………………….....252

Лабораторная диагностика коринобактериозов…...……………………..260

Лабораторная диагностика актиномикоза………………………………..269

Лабораторная диагностика нокаридиоза.…………………………………275

Лабораторная диагностика бруцеллеза…………………………………...278

Лабораторная диагностика туляремии….………………………………...296

Лабораторная диагностика пастереллеза…….…………………………...302

Лабораторная диагностика гемофилезного полисерозита поросят…......309

Лабораторная диагностика гемофилеза кур……….……………………..312

Лабораторная диагностика актинобациллезной пневмонии свиней……315

Лабораторная диагностика бортелиоза.…………………………………..321

Лабораторная диагностика инфекционного кератоконъюктивита крупного рогатого скота………………………………………………………………326

Лабораторная диагностика инфекционного тромбоэмболического менингоэнцефалита крупного рогатого скота…………………………………...329

Лабораторная диагностика контагиозного метрита лошадей…………...333

Лабораторная диагностика сапа…………………………………………...338

Лабораторная диагностика мелиоидоза…………………………………..342

Лабораторная диагностика псевдоманоза………………………………...346

Лабораторная диагностика некробактериоза…………………………….352

Лабораторная диагностика копытной гнили овец и коз…………………359

Лабораторная диагностика дизентерии свиней…………………………..364

Лабораторная диагностика кампилобактериозов….……………………..370

Лабораторная диагностика борррелиоза птиц..…………………………..384

Лабораторная диагностика микоплазмозов………………………………386

Лабораторная диагностика контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота…………................................................................................402

Лабораторная диагностика микоплазмозов крупного рогатого скота сопровождающиеся поражением респираторного, генетального тракта и молочной железы……………………………………………………………...405

Лабораторная диагностика микоплазмозов мелкого рогатого скота…...407

Лабораторная диагностика микоплазмозов свиней……………………...412

Лабораторная диагностика микоплазмозов птиц…………………….......417

Лабораторная диагностика риккетсиозов………………………………...423

Лабораторная диагностика Ку-лихорадки..………………………………423

Лабораторная диагностика инфекционного гидроперекардита животных……………………………………………………………………426

Лабораторная диагностика эрлихиозов.………………………………….428

Лабораторная диагностика неореккетсиоза собак……………………….430

Лабораторная диагностика анаплазмоза крупного и мелкого рогатого скота…………………………………………………………………………431

Лабораторная диагностика эритрозоопоза……………………………….432

Лабораторная диагностика гемабартонеллеза кошек….………………...433

Лабораторная диагностика хламидиозов…………………………………434

Лабораторная диагностика бешенства……………………………………447

Лабораторная диагностика инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота……………………………………………………………....455

Лабораторная диагностика ротавирусной инфекции крупного рогатого скота…………………………………………………………………………462

Лабораторная диагностика вирусной диареи крупного рогатого скота..469

Лабораторная диагностика парагриппа-3 крупного рогатого скота……477

Лабораторная диагностика лейкоза……………………………………….481

Лабораторная диагностика ящура………………………………………...493

Лабораторная диагностика чумы крупного рогатого скота и мелких жвачных…………………………………………………………………………..499

Лабораторная диагностика аденовирусной инфекции крупного рогатого скота…………………………………………………………………………506

Лабораторная диагностика ортомиксовирусных инфекций…………….508

Лабораторная диагностика гриппа птиц………………………………….512

Лабораторная диагностика гриппа свиней……………………………….518

Лабораторная диагностика болезни Ауески……………………………...523

Лабораторная диагностика инфекционного ларинготрахеита кур……...534

Лабораторная диагностика ньюкаслской болезни……………………….540

Лабораторная диагностика классической чумы свиней…………………547

Лабораторная диагностика инфекционного гастроэнтерита свиней…...559

Лабораторная диагностика ротавирусной диареи свиней……………….567

Лабораторная диагностика болезни Тешена……………………………..569

Лабораторная диагностика репродуктивного и респираторного синдрома свиней……………………………………………………………………….570

Лабораторная диагностика синдрома «голубой глаз» свиней…………..571

Лабораторная диагностика оспы свиней………………………………….572

Лабораторная диагностика реовирусной инфекции овец……………….575

Лабораторная диагностика оспы овец…………………………………….577

Список сокращений………………………………………………………...579

Содержание…………………………………………………………………581

Список используемой литературы………………………………………...584

Использованная литература

1. Адамов А.К., Агафонов В.И. Суспензионные антигены, антитела и иммуносорбенты. М., 1969.

2. Акатов А.К., Зуева В.К. Стафилококки. М.: «Медицина», 1983.

3. Альтон Д., Джонс A.M. Объединенный комитет ФАО/ВОЗ по бруцел­лезу. Четвертый доклад. Женева, 1995.

4. Ананьин В.В. В кн. «Лептоспирозы людей и животных». М.: «Медицина», 1971.

5. Антонов Б.И, Борисова В.В, Волкова П.М. и др. Лабораторные исследования в ветеринарии. Справочник. - М.: Агропромиздат, 1986.

6. Ахметов A.M. Сальмонеллезы животных. М.: «Колос», 1983.

7. Ашмарин И.И. Практическая медицинская микробиология. М.: «Ме­дицина», 1966.

8. Бабич М.А. Физико-химические методы контроля ингредиентов пи­тательных сред и биопрепаратов. Метод, пособие для биофабрик и вет. лабораторий. М., 1970.

9. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Косаченко Н. и др. Докл. РАСХН, 1997, № 2, с. 40-42.

10. Бакулов И.А., Гаврилов В.А., Селиверстов В.В. Сибирская язва. Владимир: «Посад», 2001.

11. Бакулов И.А., Вишняков И.Ф., Власов Н.А. и др. Особо опасные болезни животных. Покров.: ВНИИВВиМ, 1998.

12. Бектимиров М.А. Разработка методов диагностики копытной гнили овец, выделение и изучение биологии возбудителя. М., 1978.

13. Белая О.Ф., Черкасов В.Л., Белая Ю.А. и др. Реакция коагглютинации при кишечных инфекционных заболеваниях.//Методические рекомен­дации. М., 1990.

14. Белоусов В.И., Каврук Л.С, Малахов Ю.А. и др. Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных. М., 2000.

15. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомо-нозы. М.: «Медицина», 1990.

16. Ветеринарная микробиология иммунология: Учебник /Под ред. проф. Н. А. Радчука. - М. Агропромиздат 1991.

17. Костенко Т.С., Скаршевская Е.И., Гительсон С.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. М. Агропромиздат 1989.

18. Козловский Е. В, Емельяненко П.А. Ветеринарная микробиология и иммунология: Учебник. - М. Агропромиздат 1989.

19. Колычев Н. И. Ветеринарная микробиология и иммунология. Омск 1996г.

20. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. Костенко Т.С., Родионова В.Б, Скородумов Д.И. М.: Колос, 2001.

21. Клиническая иммунология: Учебник /Под ред. А.В. Караулова. – М.: МИА, 1999.

22. Сидоров М.А, Скородумов Д.И, Федотов В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. – М.: Колос, 1995.

23. Скородумов Д.И, В.В. Субботин, Сидоров М.А, Костенко Т.С. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных. – М.:ИзографЪ, 2005.

24. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология. – Изд.2-е. – М.: Агропромиздат, 1991.

25. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В.. Диагностика вирусных болезней животных. – М.: Агропромиздат, 1991.

26. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я.,Соловьев Б.В., Фомина Н.В.. Вирусные болезни животных. – М.: ВНИТИБП,1998.

27. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Соловьев Б.В., Фомина Н.В.. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. – М.: Агропромиздат, 1998.

28. Троценко Н.И., Белоусова Р.В., Преображенская Э.А.. Практикум по ветеринарной вирусологии. – М.: Колос, 1999.

269