- •Министерство сельского хозяйства
- •Формы взаимодействия микро и макро организмов
- •Характерные особенности инфекционной болезни
- •Методы лабораторных исследований
- •Лабораторная диагностикакоринебактериозов
- •Выделение и идентификация коринебактерии
- •Питательные среды
- •Бактериологическое исследование
- •Микроскопическое исследование исходного материала
- •Бактериологическое исследование
- •Микроскопическое исследование исходного материала
- •Биопроба. Проводят с целью выделения культуры возбудителя из исследуемого мате риала и проверки патогенных свойств выделенной культуры.
- •Микроскопическое исследование исходного материала
- •Выделение и идентификация культуры возбудителя
- •Питательные среды такие же как и при лабораторной диагностике актинобациллезной пневмонии свиней.
- •Микроскопическое исследование исходного материала
- •Выделение и идентификация культуры возбудителя
- •Выделение и идентификация культуры возбудителя
- •Сывороточно-дрожжевой бульон. Готовят так же, как и сывороточно-дрожжевой агар, но на основе жидкой питательной среды.
- •Лабораторная диагностика бортелиоза
- •Бактериологическое исследование
- •Выделение и идентификация бордетелл
- •Бактериологическое исследование
- •Питательные среды
- •Лабораторная диагностика сапа
- •Биопроба. Проводят с целью обнаружения возбудителя в исследуемом материале и подтверждения патогенных свойств выделенной культуры на золотистых хомячках, морских свинках.
- •Выделение и идентификация культуры возбудителя
- •Микроскопическое исследование исходного материала
- •Микроскопическое исследование исходного материала
- •Выделение и идентификация культуры возбудителя
- •Питательные среды
- •Питательные среды
- •Микроскопическое исследование исходного материала
- •Выделение и идентификация кампилобактерии
- •Серологическая диагностика
- •Питательные среды
- •Биопроба. Проводят в случаях, когда микроскопическое исследование материала дает отрицательные результаты. Заражают молодых кур, кроликов, морских свинок, белых мышей, куриные эмбрионы.
- •Питательные среды
- •Определение потребности в холестерине. От стерола не зависят ахолеплазмы, требуют его для своего роста микоплазмы, уреаплазмы и спироплазмы.
- •Питательные среды для культивирования микоплазм
- •Лабораторная диагностика контагиозной плевропневмонии крупного рогатого скота
- •Выделение и идентификация культуры возбудителя
- •Серологическая диагностика
- •Выделение и идентификация культур возбудителей
- •Микроскопическое исследование исходного материала
- •Выделение и идентификация микоплазм от овец и коз
- •Серологическая диагностика
- •Лабораторная диагностика микоплазмозов свиней
- •Микроскопическое исследование исходного материала
- •Выделение и идентификация свиных микоплазм
- •Серологическая диагностика
- •Лабораторная диагностика микоплазмозов птиц
- •Микроскопическое исследование исходного материала
- •Выделение и идентификация культур микоплазм
- •Серологическая диагностика
- •Лабораторная диагностика Ку-лихорадки
- •Бактериологическое исследование
- •Серологическая диагностика
- •Бактериологическое исследование
- •Микроскопическое исследование материала
- •Выделение и идентификация культуры возбудителя
- •Лабораторная диагностика неориккетсиоза собак
- •Микроскопическое исследование материала
- •Биопроба. На собаках путем заражения кровью или тканью селезенки можно проводить серийные пассажи возбудителя. Инкубационный период 6-12 дней. Серологическая диагностика
- •Лабораторная диагностика анаплазмоза крупного и мелкого рогатого скота
- •Микроскопическое исследование материала
- •Серологическая диагностика
- •Микроскопическое исследование материала
- •Лабораторная диагностика гемабартонеллеза кошек
- •Микроскопическое исследование материала
- •Биопроба. При внутривенном, интраперитонеальном или оральном заражении материалом кошек воспроизводится клинически выраженное заболевание.
- •Микроскопическое исследование исходного материала
- •Выделение и идентификация хламидии
- •Серологическая диагностика
- •Лабораторная диагностика бешенства
- •Индикация и идентификация вируса
- •Серологическая идентификация
- •Лабораторная диагностика ящура
- •Серодиагностика и ретроспективная диагностика
- •Лабораторная диагностика ортомиксовирусных инфекций
- •Лабораторная диагностика гриппа птиц
- •Серологическая идентификация
- •Лабораторная диагностика классической чумы свиней
- •Серологическая идентификация
- •Серодиагностика и ретроспективная диагностика
- •Индикация и идентификация вируса
- •Серодиагностика и ретроспективная диагностика
Серологическая диагностика
Для обнаружения антител при инфекции М. agalactiae апробированы РСК, ELISA -тест, тест ингибиции образования пленки и пятен.
Ретроспективную диагностику инфекции М. mycoides subsp. capri проводят при помощи ELISA, РСК, РИГА. Для групповой диагностики инфек ции М. mycoides subsp. mycoides типа LC апробирована РНГА, инфекции М. capricolum — РСК и РНГА, инфекции М. ovipneumoniae — РНГА, инфекции М. putrifaciens — РСК и пробирочная РА, инфекции М. conjunctive — тест ингибиции метаболизма.
Лабораторная диагностика микоплазмозов свиней
Основную роль в патологии свиней играют следующие виды микоплазм: M.hyopneumoniae (M.suipneumoniae) — возбудитель пневмонии (энзоотической) свиней, M.hyorhinis —возбудитель полисерозитов и полиартритов поросят. Обычным представителем микрофлоры верхних дыхательных путей является M.hyosynoviae — возбудитель артритов свиней 12 -24-недельного возраста. Кроме того, из клинических образцов могут быть выделены другие виды микоплазм (М.flocculate, M.sualvi, A.axantum, A.granularum, M.arginini, A.laidlavii и др.). Лабораторная диагностика микоплазмозов свиней основывается на результатах бактериологического исследования, а в случае инфекции M.hyopneumoniae также на данных серологических тестов.
Бактериологическое исследование
Материал для исследования. Для исследования на инфекцию M.hyopneumoniae берут на острой стадии болезни фрагменты верхушечных, сердечных и добавочных долей легких, бронхиальные лимфатические узлы. Рекомендуется брать участки легких, включающие как пораженную, так и здоровую ткань. Для предупреждения контаминации участок легочной доли пережимают широким пинцетом, обрезают позади пинцета и, не раскрывая его, помещают ткань на 7-8 секунд в кипящую воду, удаляют избыток воды и переносят материал в стерильный флакон с 8-10 мл стерильной среды для гомогенизации, затем вырезают кусочки ткани объемом 1 см3, погружают в среду, измельчают в ступке или другим способом.
Часть тканевой взвеси высевают на обычные бактериологические среды, вторую половину используют для обнаружения микоплазм. Для иммунофлуоресцентного исследования берут блок ткани размером 1 см3.
При подозрении на инфекцию M.hyorhinis и M.hyosynoviae для исследования отбирают внутрисуставную жидкость, в случае полисерозитов — плевру, перикардиум и перитониум.
Микроскопическое исследование исходного материала
Прямое обнаружение микоплазм в препаратах, окрашенных обычными способами, имеет малую диагностическую ценность. Практикуется выявление M.hyopneumoniae в материале методом иммунофлуоресценции. В этом случае один из приготовленных на предметном стекле препаратов обрабатывают антисывороткой M.hyopneumoniae, другой — нормальной сывороткой. Используют иммунопероксидазный тест для выявления M.hyopneymoniae в бронхиальном эпителии.
Выделение и идентификация свиных микоплазм
Культивирование. Выделение культур M.hyopneumoniae проводят путем посева исследуемого материала в жидкие питательные среды, т.к. на плотных средах в первичных посевах данный вид микоплазм растет плохо. Образцы исследуемого материала рекомендуют высевать в среду на основе перевара Хоттингера с дрожжевым и печеночным автолизатом. Отдельные ученые предлагают использовать модифицированную среду ВИЭВ на основе мартеновского бульона с добавлением сыворотки крови лошади, экстракта дрожжей, глюкозы, лактальбуминагидролизата. В исследуемом материале достаточно часто могут присутствовать другие виды микоплазм, в том числе растущие более быстро, чем M.hyopneumoniae, что затрудняет выделение и идентификацию культур возбудителя. Наиболее эффективно использование среды Friss с добавлением антисыворотки против M.hyorhinis и циклосерина, что обеспечивает ингибицию роста M.flocullate и M.hyorhinis.
Рекомендуется тканевой материал после измельчения в питательной среде в ступке или гомогенизаторе подвергнуть центрифугированию при 1,5 тыс. об/мин в течение 15 минут, надосадочную жидкость обработать ацетатом таллия и пропустить через стерилизующие фильтры, посеять на среды для микоплазм и с целью контроля на МПА, МПБ, среду Кита-Тароцци. Инкубирование проводить при 37° С до 10 суток с ежедневным просмотром сред. При отсутствии изменений в среде через 4-6 суток делают до 2-5 «слепых пассажей» с параллельными высевами на плотные среды.
Другие исследователи предлагают следующую апробированную схему бактериологического исследования: тканевый гомогенат (1:10) разводят в среде Friss до 104 и инкубируют при 37° С до трех недель. M.hyopneumoniae лучше растет, если культивирование осуществляется роллерным способом. Посевы просматривают ежедневно на наличие помутнения и изменения рН. В положительных случаях помутнение среды слабое, рН меняется обычно на 5-6-е сутки, при малом содержании возбудителя — позднее. Аналогичные измения на среде Friss без циклосерина и антисыворотки против M.hyorhinis могут вызвать M.flocullate и M.hyorhinis, причем последний вид растет быстро. Параллельно один миллилитр разведения 102 добавляют к 50 мл среды, пропускают через целлюлозный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Затем фильтр помещают в питательную среду, культивируют, отслеживая изменения рН, споласкивают, высушивают и исследуют на наличие микроколоний в непрямой реакции иммунофлуоресценции.
При подозрении на инфекцию M.hyorhinis (полиартриты, полисерозиты) производят посев материала на среду Friss без циклосерина, антисыворотки или на другие среды для микоплазм, на большинстве из которых этот вид микоплазм хорошо растет. Из материала делают разведения на среде Friss до 103-104, инкубируют при 37° С, отслеживая изменения рН, появление помутнения. При наличии бактериальных контаминатов отмечают интенсивное помутнение среды в низких разведениях, закисление или защелочение рН. С целью выявления M.hyosynoviae материал (суставная жидкость, синовиальные мембраны) измельчают 1:10 и готовят на бульоне для M.hyosynoviae разведения 103-104. Посевы инкубируют при 37° С с ежедневным контролем. Рост M.hyosynoviae сопровождается слабым помутнением среды или его отсутствием, защелочением рН и образованием пленки, на стенках пробирки формируется мыло-подобный налет. При посеве на агаризованную среду (7% агар Нобеля) большинство штаммов образуют пленки и пятна, а также отложения на колониях «перламутровых кристаллов». Выделение чистых культур M.hyopneumoniae, M.hyorhinis и M.hyosynoviae проводят по стереотипной схеме.
Идентификация выделенных культур микоплазм. Выделенные чистые культуры микоплазм идентифицируют по совокупности культуральных, ферментативных признаков, гемагглютинирующей активности. При этом определяют способность микоплазм утилизировать глюкозу, маннозу, аргинин, разжижать желатин, казеин, сыворотку, редуцировать тетразол, образовывать фосфатазу, пленки и пятна при росте на питательных средах, а также агглютинировать эритроциты. Характеристики основных видов свиных микоплазм приведены в таблице 94.
При идентификации M.hyopneumoniae в реакции иммунофлуоресцен-ции рекомендуется 2 мл первичной культуры в разведении 101 пропустить через мембранный фильтр с порами диаметром 0,2 мкм, потом поместить их в среду Friss и инкубировать при 37° С 5-6 дней, что приводит к образованию на фильтрах микроколоний возбудителя, которые идентифицируют непосредственно на мембранных фильтрах следующим образом.
Таблица 96 - Дифференциальные признаки свиных микоплазм
Признаки, тесты |
Вид микоплазм | |||
|
M.hyopneumoniae |
M.hyosinoviae |
M.hyorhinis |
M.flocullate |
Глюкоза |
+ |
- |
+ |
+ |
Аргинин |
н.д. |
+ |
- |
- |
Уреаза |
- |
- |
- |
- |
Фосфатаза |
н.д. |
- |
+ |
- |
Тетразол |
-/w |
-/- |
+ /+ |
-/w |
Желатин |
н.д. |
н.д. |
- |
W |
Казеин |
н.д. |
н.д. |
- |
н.д. |
Разжижение сыворотки |
н.д. |
+ |
- |
н.д. |
Пленки, пятна |
н.д. |
+ |
- |
|
Примечание: аэробно/анаэробно, w— слабая реакция, н.д. — нет данных.
Фильтр помещают в стерильный фосфатно-солевой буферный раствор (рН 7,5) и отмывают на магнитной мешалке в течение 10 минут.
Фильтр берут пинцетом и ополаскивают в аналогичном буфере.
Просушивают мембраны на стерильной фильтровальной бумаге, подписывают, разрезают на 3 части, в соответствии с подписями (1,2,3).
Каждую часть фильтра помещают в лунку планшета; к отдельным частям фильтра добавляют предварительно разведенные сыворотки M.hyopneumoniae, M.flocullate и нормальную кроличью сыворотку, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут.
Каждую часть фильтра споласкивают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,5), а затем отмывают в аналогичном растворе на магнитной мешалке в течение 10 минут.
Фрагменты фильтра просушивают на бумаге, вновь помещают раздельно в лунки планшета, к каждому сегменту фильтра добавляют рабочее разведение антикроличьей люминесцирующей сыворотки и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 минут.
Споласкивают в фосфатно-солевом буфере (рН 7,5), затем отмывают в аналогичном растворе при помощи магнитной мешалки в течение 10 минут.
Подсушивают кусочки фильтра на бумаге, помещают все три фрагмента на предметное стекло, наносят на них по капле забуференного глице рина, покрывают покровным стеклом и исследуют при помощи люминесцентного микроскопа как при методе эпифлуоресцеиции.
При исследовании антисыворотку M.hyopneumoniae необходимо проверить на перекрестные реакции с M.flocullate. При обнаружении реагирующих антител проводят адсорбцию сыворотки: 10 мл антисыворотки M.hyopneumoniae смешивают с центрифугатом 100 мл бульонной культуры M.flocullate, смесь выдерживают 1 час при 37° С, ночь при 4° С, центрифугируют, над осадочная жидкость представляет собой адсорбированную иммунную сыворотку.
Обычно идентификацию микоплазм осуществляют методом флуоресцентного окрашивания колоний на агаровой среде Friss или на мембранных фильтрах. Тест ингибиции роста также может быть использован для этой цели, но из-за штаммовых антигенных различий результат может быть неоднозначным.
Идентификацию культур M.hyosynoviae осуществляют на основании изучения признаков, а также в тесте ингибиции роста, иммунофлуоресцентного окрашивания колоний на агаровой среде или микроколоний на мембранных фильтрах.
Биопроба. Используют при диагностике инфекции, вызываемой M.hyopneumoniae. Для заражения берут поросят-сосунов или животных 2-3-месячного возраста, желательно выращенных без молозива, из хозяйств, благополучных по данной инфекции. В качестве материала для заражения используют надосадочную жидкость легочной суспензии (1:100), обработанную ингибиторами, провереннную на наличие бактериальных контаминантов, или тканевый материал предварительно пропускают через мембранные фильтры. Заражение проводят интраназально или трахеально.
Инкубационный период обычно составляет 7-10 суток, диагностический убой целесообразно проводить через 15-20 суток. Из клинических симптомов наиболее типичен кашель, температурная реакция может быть слабой или совсем отсутствовать. В положительных случаях в легких обнаруживают характерные изменения, подтверждением служит реизоляция культур, наличие серологического ответа.