Биопроба. Проводят в случаях, когда микроскопическое исследование материала дает отрицательные результаты. Заражают молодых кур, кроликов, морских сви­нок, белых мышей, куриные эмбрионы.

Кровь и кусочки паренхиматозных органов объединяют, измельча­ют в ступке, разводят физиологическим раствором 1:10-1:20 и вводят курам внутримышечно по 2 мл или внутрибрюшинно, соответственно по 1-2,1 и 0,5 мл. При использовании для заражения свежей крови от больной птицы ее вводят животным внутривенно. О результатах био­пробы судят по результатам микроскопического исследования крови животных в период с 48 до 72 часов после заражения (позднее борре­лий могут исчезнуть). Зараженные птицы могут погибать, но не всегда. Для обнаружения возбудителя у зараженной птицы, кроме, того исполь­зуют РИФ и РДП.

Питательные среды

Сыворотка крови кролика или лошади. Стерильную, инактивированную (58-60° С, 30 минут) сыворотку раз­ливают по пробиркам, вносят небольшое количество стерильного вазели­нового масла.

Свернутый куриный белок с сывороткой крови. Стерильно взятый куриный белок разливают по стерильным пробиркам и свертывают в скошенном состоянии в водяной бане. Затем в каждую про­бирку вносят по 5 мл инактивированной сыворотки крови, разведенной сте­рильным физиологическим раствором 1:5 (сыворотка кролика), 1:50 (сыво­ротка лошади).

Среда Терских. См. «Лептоспироз».

Лабораторная диагностика микаплазмозов

Микоплазмы — прокариоты, не имеющие клеточной стенки и ограничен­ные лишь трехслойной мембраной. Обладают полиморфизмом (кокки, нити, ветвистые структуры), растут на бесклеточных питательных средах. В свя­зи с отсутствием клеточной стенки чувствительны к осмотическому шоку. Для предотвращения осмотического лизиса в состав питательных сред вклю­чают стабилизирующие соли и другие вещества. Патогенные микоплазмы для роста на искусственных питательных средах требуют добавления мно­гих компонентов, которые они не способны синтезировать сами. В состав сред обязательно включают сыворотку крови как источник липопротеина. Наряду со стеринами, фосфолипидами, липидами патогенным микоплаз-мам необходим низкомолекулярный белок. В связи с вышеизложенным ми­коплазмы выращивают на средах с сывороткой крови, экстрактами дрож­жей, сердечной мышцы, добавлением мембранных липидов или их предше­ственников.

Температурный оптимум для микоплазм, уреаплазм и ахолеплазм со­ставляет 37-38° С, рН 7,8-8,0, кроме уреаплазм (оптимум рН 6,0).

Все микоплазмы выделены в самостоятельный класс Mollicules с одним отрядом — Mycoplasmatales, который подразделяется на три семейства: Mycoplasmataceae, Acholeplasmataceae, Spiroplasmataceae. Семейство Mycoplasmataceae включает два рода: Mycoplasma и Ureaplasma. Семей­ство Acholeoplasmataceae имеет один род — Acholeoplasma. Семейство Spiroplasmataceae представлено одним родом — Spiroplasma.

Схема бактериологического исследования при диагностике микоплазмозов

Материал берут на ранних стадиях клинического проявления болезни, от трупов животных не позднее 2-3 ч после гибели, с максимальным соблю­дением стерильности и транспортируют в термосе со льдом. Изоляция ми­коплазм наиболее вероятна, если посев на питательные среды произведен в первые пять часов после взятия материала. Для хранения в течение 2-3 суток материал замораживают при -20° С, для более длительного — при -70°С или помещают в жидкий азот. Материал, взятый тампонами, целесооб­разно помещать в транспортную среду для микоплазм. При транспортировке образцов маститного молока рекомендуется в него добавлять 5 мкг/мл ампи­циллина.

Прямое микроскопическое обнаружение микоплазм в окрашенных пре­паратах из исследуемого материала из-за полиморфизма, слабого восприя­тия красителей и хрупкости клеток имеет небольшую диагностическую ценность. Более эффективно обнаружение и идентификация микоплазм при по­мощи метода флуоресцирующих антител, ИФА, ПЦР.

С целью выделения культуры микоплазм обычно материал высевают в две пробирки с жидкой питательной средой и в две чашки Петри с агаровой средой. Экссудат и фетальную жидкость высевают на среды без предва­рительной обработки. Тканевый материал и внутрисуставная жидкость могут содержать ингибиторы, поэтому их разводят в жидкой питательной среде до 10"⁶ и каждое разведение инкубируют. Ткани предварительно го­могенизируют. Гомогенизацию проводят в фосфатном буферном растворе или жидкой питательной среде. Чрезмерно измельчать ткани не рекоменду­ется из-за выделения ингибиторов, приготовление разведений гомогената преследует эту же цель.

Наряду с посевом гомогената рекомендуется производить посев блока­ми тканей, например легочной, непосредственно на агаровую среду. С це­лью подавления роста обычных бактерий и грибов исследуемый материал (гомогенат) перед посевом обрабатывают. Для этого взвесь тканевого ма­териала разводят фосфатно-солевым раств ором 1:10, фильтруют через сте­рильный ватно-марлевый фильтр, к фильтрату добавляют пенициллин (5000 ЕД/мл), при значительной контаминации — полимиксин В (100 ЕД/мл), аце­тат таллия (1:2000-1:4000), для подавления грибов — амфотерицин В (50 мкг/мл), чаще используют пенициллин и ацетат таллия. Взвесь с анти­биотиками выдерживают при комнатной температуре 40 минут и делают контрольный высев на МПА и МПБ. Материал сохраняют при 5-10° С. В случае роста бактерий деконтаминацию проводят повторно. Другим спо­собом освобождения от контаминантов является пропускание материала через мембранные фильтры 3 и 4.

Плотные питательные среды лучше разливать в стеклянные чашки Петри, т.к. неко­торые виды пластмасс ингибируют рост микоплазм.

Посевы на плотных средах инкубируют в течение 5-14 суток в аэроб­ных и анаэробных условиях при 37-38°С, а поскольку культивирование достаточно длительное, во избежание подсыхания сред его проводят при относительной влажности около 75-80%. Наилучшие результаты удается получить при использовании культуральных сосудов с 5-10% СО₂. Пробирки с посевами в жидкие питательные среды инкубируют в аэробных условиях и ежедневно контролируют на на­личие роста.

Для подтверждения роста микоплазм на жидких питательных средах производят высевы на плотную питательную среду. Результат посева на плотные среды признают отрицательным при отсутствии роста в течение 14 суток. На плотных средах наличие колоний обнаруживают под малым уве личением микроскопа (х25 х50). При отсутствии роста проводят до 8 пас­сажей на жидкой среде с пятидневным интервалом, прежде чем дают отри­цательное заключение. С целью выделения уреаплазм пассажи проводят на специальных средах ежедневно.

Микоплазмы образуют довольно характерные колонии на плотных пи­тательных средах. Центр колонии темный, периферия прозрачная. Рельеф: центр приподнятый («пуговчатый»), периферическая часть колонии плос­кая (форма «яичницы-глазуньи»). Центральная часть колонии врастает в толщу питательной среды, что обнаруживают путем снятия бактериальной массы фламбированным скальпелем или бактериологической петлей с пос­ледующим изучением участка среды под колонией при помощи микроско­па.

При обнаружении колоний, сходных с колониями микоплазм, проводят клонирование на средах без ингибиторов с целью получения чистой куль­туры. Из бульонной культуры готовят разведения 10^-1-1^-10, каждое из ко­торых (0,2-0,3 мл) высевают на две чашки Петри с агаровой средой. Для выделения чистой культуры используют два основных методических при­ема. В первом случае вырезают блок агаровой среды, содержащий одну колонию, переворачивают и засевают на поверхность плотной питатель­ной среды. Посевы инкубируют 48-72 часа. Процедуру повторяют уже с тремя изолированными колониями. Во втором случае агаровый блок поме­щают в пробирку с 2-3 мл жидкой питательной среды, инкубируют 48 ча­сов при 37° С, культуру пропускают через мембранные фильтры (диаметр пор 0,45 мкм). Фильтрат разводят свежей средой 1:10 и 1:100 и по бактерио­логической петле каждого разведения высевают на агаровую среду. Про­цедуру повторяют троекратно с несколькими колониями, т.к. не все коло­нии дают хороший рост.

Под воздействием ингибиторов, входящих в состав питательных сред для первичного культивирования микоплазм, возможна L-трансформация бактериальных контаминантов, что требует дифференциации колоний L-форм бактерий и микоплазм.

Колонии L-форм бактерий имеют сходную морфологию, но менее про­зрачны и имеют выраженную зернистую структуру.

Для более точной дифференциации микоплазм от L-форм бактерий про­изводят высев колоний на питательную агаровую или жидкую среду без пенициллина и ацетата таллия. Посевы инкубирют в течение пяти дней, периодически просматривая на наличие колоний на агаре и типичных бак­териальных клеток в жидкой среде. Их присутствие свидетельствует о ре­версии L-форм в исходное состояние.

Кроме того, колонии микоплазм и L-форм бактерий дифференцируют при окраске по методу Динес. Для этого вырезают агаровый блок с изучаемой колонией, наносят несколько капель красителя Динес (метиленовый голубой — 2,4 г, мальтоза — 10 г, азур II — 1,25 г, натрия хлорид — 0,25 г, дистиллированная вода — 100 мл) на несколько минут, промывают блок водой и исследуют. Первоначально все колонии окрашиваются в синий цвет, но через пятнадцать минут колонии бактерий, в отли­чие от микоплазм, обесцвечиваются за счет редукции метиленового синего. Также учитывают, что колонии обычных бактерий при окраске могут смы­ваться, а микоплазм нет.

Для определения морфологических и тинкториальных свойств клеток микоплазм готовят на стеклах отпечатки колоний, бульонную культуру цен­трифугируют при 10-15 тыс.g, осадок однократно отмывают дистиллиро­ванной водой и готовят мазки. Препараты фиксируют метанолом, ацето­ном и окрашивают по Граму и краской Романовского-Гимза (1:10) 3-4 часа. По Граму микоплазмы окрашиваются отрицательно, красителем Ро­мановского-Гимза микоплазмы и ахолеплазмы — в светло-фиолетовый, уреаплазмы — в красно-фиолетовый цвет.

Культуры микоплазм в процессе работы поддерживают путем пересева на жидких питательных средах с интервалом 2-3 недели и хранят при 4-5° С. Агаровые культуры сохраняют в замороженном состоянии в виде ага­ ровых блоков при-30 40° С.

Родовую идентификацию выделенных чистых культур микоплазм (роды Mycoplasma, Ureaplsma, Acholeplasma) осуществляют по чувствительнос­ти к дигитонину и уреазной активности с учетом диаметра микроколоний по схеме, представленной ниже.

Видовую идентификацию микоплазм осуществляют путем дальнейшего изучения дополнительных характеристик, ферментативной активности. На различных этапах бактериологического исследования применяют сероло­гические методы идентификации микоплазм. При диагностике некоторых микоплазмозов практикуется проведение биологической пробы и сероло­гическая диагностика.

Основные методы исследований, используемые при идентификации ми­коплазм, изложены ниже.

Методы идентификации микоплазм

При росте некоторых видов микоплазм на плотных питательных средах образуется пленка и зерна. Пленка состоит из холестерола и фосфолипи-дов, зерна — из выпавших в осадок солей магния и кальция, что является следствием липолитической активности микоплазм в отношении жирных кислот. Для проведения данного теста расплавляют 75 мл агара с сердечным отваром («Дифко»), добавляют 20 мл сыворотки крови лошади, инактивированной при 56°С в течение 30 минут, 5 мл стерильного дрожжевого экстракта. До автоклавирования агаровой основы устанавливают рН 7,8, после автоклавирования агар охлаждают до 56° С, вносят остальные ингредиенты и разливают по чашкам Петри. Посевы инкубируют при 37°С. Использование стереоско­пического микроскопа облегчает раннее обнаружение изменений. Не реко­мендуется инкубирование посевов более двух недель, так как возможны ложные позитивные реакции.