Микроскопическое исследование исходного материала

Из исследуемого материала готовят и микроскопируют мазки, окрашен­ные по Граму. Клетки P. aeruginosa имеют вид прямых или изогнутых грамотрицательных палочек размером 1,5-3x0,5-1,0 мкм, располагающихся одиночно, парами, в виде коротких цепочек. Вирулентные штаммы проду­цируют значительное количество капсулоподобного слизистого вещества. В мазках — отпечатках из тканевого материала клетки P. aeruginosa часто обнаруживаются внутри фагоцитов.

Выделение и идентификация культур P. Aeruginosa. Культивирование. Pseudomonas aeruginosa — аэроб, температурный оптимум — 35-37° С, диапазон 4-42° С, рН — 7,2, к питательным средам неприхотлив. Иссле­дуемый материал высевают на МПА, кровяной МПА или селективную сре­ду, содержащую цетилтриметил аммония бромид (цетримид), на которой другие псевдомонады не растут. Посевы культивируют в аэробных усло­виях при 35-37° С в течение 24 часов.

На МПА P. aeruginosa формирует крупные (2-5 мм), сероватые, с неров­ными, волнистыми распространяющимися плоскими краями, полупрозрач­ные, с гладкой поверхностью и приподнятым центром колонии, часто отли­вающие металлическим блеском, кроме того, могут быть мелкие, шерохова­тые колонии, напоминающие маргаритки. Штаммы, выделенные из респира­торного и мочеполового тракта, могут образовывать слизистые или мукоидные колонии. На кровяном агаре колонии часто окружены зоной β-гемолиза. Культуры P. aeruginosa имеют фруктовый запах, прозрачные среды в про­цессе роста окрашивают в зеленоватый или зеленовато-желтый цвет. Пигментообразование — важный таксономический признак, обнаруживаемый приблизительно у 80% штаммов. Для выявления пигмента исследуемую куль­туру выращивают на средах «А» и «В» в течение суток при 35° С. Пигмент пиоцианин растворим в воде и хлороформе, окрашивает питательные среды в сине-зеленый цвет. Цвет пигмента у культур на специальных средах для выявления псевдомонад варьирует от бледно-голубого до темно-синего или зеленого на среде «А» и ярко-зеленого на среде «В». P. aeruginosa — единственный известный вид бактерий, продуцирующий пиоцианин. В щелочной среде пиоцианин имеет го­лубой цвет, в кислой — розовый. Для выявления этого пигмента культуру выращивают на скошенном агаре, вносят 1-2 мл хлороформа, перемеши­вают, хлороформ при наличии пиоцианина синеет. Окрашенный хлороформ переносят пипеткой в пробирку и вносят 1-2 капли IN HC1, после чего пио­цианин розовеет (кислая среда). Пиоцианин наиболее часто образуют виру­лентные штаммы P.aeruginosa. Пигмент флуоресцеин (пиовердин) — зеле­ный пигмент, растворим в воде, но не хлороформе, флуоресцирует при осве­щении культуры, выращенной на среде «В» в темноте, ультрафиолетовыми лучами с длиной волны 254 мм, его вырабатывают большинство штаммов. Синтез пиовердина стимулирует среда «В», а также культивирование при 25° С. Цвет пигмента пиорубина у культур на среде «А» варьирует от розово­го до темно-каштанового. Пигмент пиомеланин — темно-коричневый, син­тезируют некоторые штаммы P. aeruginosa на среде «В». Часть изолирован­ных штаммов (8-18%) может не образовывать пигменты, что затрудняет идентификацию и требует проведения дополнительных исследований свойств культуры. Спектр пигмен­тов, образуемых P.aeruginosa и другими псевдомонадами, представлен в таб­лице 79. Определение наличия пигмента и его типа — важный этап в иден­тификации P. aeruginosa.

В МПБ рост P.aeruginosa проявляется образованием поверхностной серебристо-белой пленки, что считается характерным признаком. Позднее среда мутнеет (вначале в верхней части столбика среды, далее — в ниж­ней), формируется серовато-белый осадок. За счет пигмента среда приоб­ретает сине-зеленый цвет, который позднее становится бурым.

Морфология клеток P. aeruginosa в культуре. Морфология клеток в культуре идентична таковой в препаратах из па­тологического материала. Клетки подвижные, имеют один, иногда два по­лярных жгутика, способность к слизеобразованию в процессе пассирова­ния на питательных средах быстро утрачивают, спор не образуют. Под­вижность исследуют микроскопически у бульонных культур, выращенных при 18-20° С.

Идентификация P.aeruginosa с учетом температурного диапазона роста, пигментообразования и ферментативных признаков

При обнаружении в материале культур, способных расти на цетримидном агаре, образующих колонии с признаками, характерными для Р. aeruginosa, проводят микроскопическое исследование мазков, окрашенных по Граму. Исследуют способность к слизеобразованию, пигмеитообразованию и тип пигмента.

Таблица 83 - Пигментообразование у P.aeruginosa и некоторых других псевдомонад

Вид бактерий	Тип пигмента
	Диффундирующие флуоресцирующие	Диффундирующие нефлуоресцирующие	Недиффундирующие нефлуоресцирующие
P.aeruginosa	+	+ сине-зеленый	-
P.alcaligenes	-	-	dжелто-оранжевый
P.caryophylli	-	+ желто-зеленый	-
P.cepacia	-	+ различные	-
P.chlorarphis	+	-	+ зеленый или оранже­вый
P.cichorii	+	-	_
P.delafieldii	-	-	_
P.diminuta	-	-	_
P.facilis	-	-	_
P.fluorecyens биотип I	+
биотип II	+	-	_
биотип III	+	-	_
биотип IV	+	-	_
биотип V	+	-	+ синий
P.gladioli	-	+ желто-зеленый	-
P.mendocina	-	-	+ желто-оранжевый
P.pickettii	-	-	_
P.pseudoalcaligenes	-	-	_
P.putida биотип А	+	-	__
биотип В	+	-	_
P.saceharophila	-	-	_
P.solancearum	-	d коричневый	-
P.stutzeri	-	-	_
P.syringae	+	-	_
P.vesicularis	-	-	+ желто-оранжевый
P.viridiflava	+	d сине-зеленый

В случае выявления типичных грамотрицательных палочек проверяют их оксидазную и каталазную активность.

Для дальнейшего исследования отбирают колонии оксидазо- и каталазопозитивных бактерий. Исследуют у выделенных культур подвижность, способность к восстановлению нитратов, образованию газа из нитрата, пеп-тонизации молока, гидролизу желатины, утилизации цитратов, синтезу пиг­ментов (см. выше), аргининдигидролазы, способность к росту при 25° С, 35° С, 42° С, в МПБ без NaCl, образованию кислоты из D-глюкозы, D-ксилозы, D-маннита. Для P.aeruginosa характерны свойства, отраженные в таблице 80. Может быть использова­на тест-система NEFERV test 24 (PLIVA-Lachema).

Серологическая идентификация

У P. aeruginosa выявлено семнадцать О-сероваров. Существовало мно­го различных схем их обозначения, которые объединены в одну междуна­родную на основе схемы Habs, соответствие которой прежним схемам пред­ставлено в таблице 81. Строение О-антигенов возбудителя внутри этих групп отражено в таблице 82.

Кроме О-сероваров у возбудителя идентифицированы Н-серовары, ко­торые в отличие от сальмонелл не имеют вариаций. По Н-антигенам P.aeruginosa подразделяют на 1 и 2-ю группы. В свою очередь, в первой группе выделяют подгруппы Н:1а и Н:lb, а во второй — 6 подгрупп. По данным многих авторов, большинство клинических штаммов P. aeruginosa при использовании коммерческих агглютинирующих сывороток удается отнести к О-сероварам 2, 3, 6, 7 и 11.

Для идентификации культур P. aeruginosa, выделенных при псевдо-монозе норок, на уровне О-серогруппы, в РФ рекомендуется использовать набор из трех поливалентных и одиннадцати моновалентных сывороток. Как антиген применяют 18 -20-часовую агаровую культуру концентра­цией 3-5 млрд. микробных клеток в 1 мл, инактивированных кипячением в водяной бане в течение 1,5 часов. Культуру (антиген) первоначально исследуют с поливалентными сыворотками (№ 1 — 03, 04, 05, 06, 07; № 2 — 02, 08, 09; № 3 — 010, 011, 012) и при получении положительного результа­та — с моновалентными, входящими в состав той или иной поливалентной сыворотки. РА проводят в капельном варианте на стекле, результат учиты­вают через 3-6 минут.

Питательные среды. Цетримидный агар. Цетримид (цетилметиламмония бромид) — 0,3 г; пептон — 20,0 г; маг­ний хлористый — 1,4 г; калий сернокислый — 10,0 г; глицерин — 10,0 г; агар — 13,0 г; вода дистиллированная —до 1000,0 мл; рН среды — 7,2.

Таблица 84 - Свойства P. aeruginosa

Признаки	% положительных реакций
Образование кислоты из: D-глюкозы	97
D-ксилозы	90
D-маннита	70
Лактозы	<1
Сахарозы	0
Мальтозы	<1
Каталаза	100
Оксидаза	99
Рост на среде: Мак-Конки	100
SS-arape	96
Цстримид-агаре	94
Утилизация цитрата	95
Уреаза на среде Кристенсен	48
Восстановление нитратов	98
Газ из нитрата	93
Индол	0
Скошенный агар TSI, кислота	0
Столбик TSI, кислота	0
H2S (столбик TSI)	0
H2S(бумага с ацетатом РЬ)	4
Желатиназа	82
Лакмусовое молоко	89 (пептонизация)
Пигмент: Пиовердин	65
Пиоцианин	46
Пиорубин	25
Другие	23 (пиомеланин)
Рост при 25° С	100
35° С	100
42° С	100
Гидролиз эскулина	0
Лизиндекарбоксилаза	0
Аргининдигидролаза	100
Орнитиндекарбоксилаза	0
МПБ, 0% NaCl	100

Примечания: SS— агар — сальмонелла — шигелла — агар.

Таблица 85 - Соответствие схем обозначения О-антигенов

P.aeruginosa (Беляков В.Д. и соавт., 1990)

Международ­ная	Habs	Ноmmа	Lanyi	Verder-Evans	Fiseher	Meitert
1	1	10	6	4	4	13
2	2	2	3	-	3,7	2
3	3	1	1	6	-	5
4	4	6	11	-	-	8
5	5	7	3	1	7	6
6	6	8	4	2	1	1,4
7	7	3	5	8	6	3
8	8	3	5	8	6	3
9	9	4	10	9	-	14
10	10	9	2	-	5	11
11	11	5	7	3	2	15
12	12	14	13	7	-	7
13	-	12	-	-	-	-
14	_-	12	-	5	-	-
15	_-	11	12	-	-	-
16	_-	13	3	-	-	-
17	-	-	-	-	-	10
-	-	16	-	10	-	16

Цетримидный агар готовят следующим образом: агар с экстрактом сер­дечной мышцы (Difko) — 40 г, цетримид — 4 мл 22,5%-ного раствора в ди­стиллированной воде, вода дистиллированная — до 1000,0 мл. Среду раз­ливают по 5 мл в пробирки, автоклавируют при 121°С в течение 15 минут, скашивают. Испытуемую культуру инкубируют при 35°С до 7 суток. Куль­туры P. aeruginosa на этой среде растут.

Среда A («Tech») для выявления пигментообразования. Бакто-пептон (Difko) — 20 г; глицерол —10; хлористый магний —1,4 г; сернокислый калий —10 г; агар —15 г; дистиллированная вода —1000 мл, рН доводят до 7,2, автоклавируют в пробирках при 121°С 15 минут.

Среда В («Flo») для выявления пигментообразования. Протеозо-пептон № 3 (Difko) — 20 г; глицерол — 10 мл; фосфорнокислый калий двухзамещенный безводный — 1,5 г; MgS0₄ х 7 Н₂0 — 1,5 г; дистилли­рованная вода — до 1000 мл. Стерилизуют в пробирках при 121°С 15 минут.

Таблица 86 - Строение О-антигенов P.aeruginosa

Группа		О-антигены
	групповые	парциальные
1	1	-
2	2а	2b ;2c ;2d ;2d2e ;2d2f ;2b2e ;2b2c
3	За	3b;3b3c;3d
4	4а	4b;4c
6	6а	6b;6c;6d
7	7а	7b7c;7b7d;7d
9	9а	9b9d;9c;9d
10	10а	10b;10c
11	Па	llb;llc
12	12	-
13	13а	13b;13c
14	14	-
15	15	-

Примечание:Одинаковые буквенные наименования антигенов обозначают их идентичность только в пределах одной группы. Парциальный состав О-анти­генов групп 1, 12, 14 и 15 не расшифрован.

Агар с экстрактом сердечной мышцы (Difko). Экстракт сердечной мышцы крупного рогатого скота — 500 г; Bacto-триптон —10 г; хлористый натрий — 5 г; Bacto-agar — 15 г; дистиллиро­ванная вода — до 1000 мл.

Лабораторная диагностика некробактериоза

Некробактериоз — инфекционная болезнь, характеризующаяся гнойно-не­кротическими поражениями, локализующимися на нижних частях конечнос­тей, а в отдельных случаях — в ротовой полости, на вымени, половых орга­нах, в печени, легких, мышцах и других тканях и органах. Возбудителем болезни является анаэробная грамотрицательная бак­терия — Fusobacterium necrophorum. Род Fusobacterium содержит 17 видов. Из клинических образцов от животных, наряду с F. necrophorum, могут быть выделены другие виды фузобактерий: из кишечного тракта — F.gonidioformans, F.necrogenes, F.russii, F.pseudonecrophorum; со слизистой ротовой полости — F.simiae. В зависимости от вида и возраста животных проявление некробактериоза может иметь некоторые особенности.

F.necrophorum в сочетании с Actinomyces pyogenes вызывает форму не­кробактериоза, именуемую дифтерией телят, кото­рая сопровождается образованием некротических фокусов в области гор­тани, трахеи, грудной полости, а также абсцессов в печени. У взрослого крупного рогатого скота F.necrophorum также может быть причиной пора­жения конечностей, метритов, маститов. У овец F.necrophorum вызывает преимущественно поражение конечностей, кожи губ, слизистых ротовой полости и половых органов. У свиней некробактериоз при кожной форме сопровождается поражениями в области шеи, туловища, вымени, кончи­ков ушей, хвоста. Могут развиваться некротический энтерит, абсцессы в печени. У лошадей некробактериоз чаще проявляется в виде гангренозно­го дерматита конечностей, у северных оленей — флегмонозно-гнойным вос­палением нижних фаланг конечностей, артритами. У собак поражаются хвост, кожа вокруг ануса, лапы, слизистые губ и носа.

Лабораторная диагностика некробактериоза основана на резуль­татах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование

Для исследования прижизненно берут соскобы на границе здоровой и некротизированной тка­ни из области венчика, межкопытной щели, ротовой полости, ноздрей и т.д. Трупы мелких животных доставляют в лабораторию целиком, от круп­ных животных — паренхиматозные органы и ткани с некротическими оча­гами. Следует учитывать, что материалы из кожных поражений, слизистой ротовой и носовой полостей, трахеи, гортани, кишечника, содержат дру­гие анаэробные грамотрицательные бактерии из категории представите­лей нормальной микрофлоры и не только рода Fusobacterium, что значи­тельно осложняет исследование. По указанной причине вероятность выде­ления культуры возбудителя выше, если объектом исследования является гной из абсцессов, жидкость из пораженных суставов, грудная или перитонеальная жидкость, внутренние органы с поражениями. Возбудитель отли­чается слабой устойчивостью, поэтому образцы материала в лабораторию необходимо направлять в кратчайшие сроки, желательно в анаэробных контейнерах. Для транспортировки образцов под­ходит модифицированная транспортная среда Cary-Blair. Материал луч­ше транспортировать и хранить при температуре выше температуры холо­дильника, так как при низких температурах кислород сорбируется сильнее. В любом случае материал должен быть подвергнут исследованию в течение нескольких часов после взятия.

В соответствии с «Методическими указаниями по лабораторной диаг­ностике некробактериоза» (М., 1985) материал для лабораторного иссле­дования направляют в свежем виде или консервируют 30%-ным раствором глицерина.

Микроскопическое исследование исходного материала. Мазки окрашивают по Граму, методу С.Н.Муромцева и Л.Новиковой (цит. по Львову В.М., 1960). В последнем случае препараты фиксируют спирт-формалином (4:1) в течение 10 минут и затем 30 секунд окрашивают ра­створом фуксин-синьки. Микроскопическая картина: фон — фиолетово-розовый, бактерии — сине-голубые. Приготовление красителя: основной фуксин — 0,15 г, этанол 95° — 20 мл, фенол — 10 мл, метиленовый синий — 0,25 г, вода — 200 мл.

Четкая микроскопическая картина получается при фиксации мазков спирт-эфиром и окрашивании в течение 2-3 секунд фуксином Циля. Мо­жет быть использована окраска по Романовскому-Гимза. В мазках-отпе­чатках из исследуемого материала F.necrophorum имеет форму длинных, иногда переплетающихся, неравномерно окрашенных грамотрицательных нитей, длиной 10-100 и более мкм, шириной 0,75-1,0 мкм. Длинные нити часто имеют утолщения. Кроме нитей обнаруживаются единично располо­женные палочковидные клетки или цепочки из нескольких клеток, концы могут быть округлыми или заостренными. Нитевидные формы преоблада­ют в пораженной ткани на границе со здоровой. Ближе к здоровой ткани количество нитей уменьшается. В мазках, сделанных из центра некроти­ческого фокуса, возбудитель обычно обнаруживается в виде коротких па­лочек, нити встречаются реже. В мазках из плевральной и перикардиальной жидкости возбудитель имеет преимущественно форму длинных нитей.

В мазках из материала могут быть выявлены клетки F.pseudonecrophorum, которые чаще имеют форму правильных коротких палочек или кокков. F.russii обнаруживается в форме нитей, без утолще­ний, концы заостренные. Короткие и кокковидные клетки, как правило, не встречаются.

F.simiae обычно имеет форму палочек с заостренными концами, клеток с утолщениями и колбовидных форм нет. F.necrogenes и F.gonidiaformans по морфологии идентичны F.necrophorum. F.naviforme преимущественно имеет форму правильных палочек с заостренными концами.

Кроме того, в материале из пораженных конечностей вероятно присут­ствие бактерий из рода Bacteroides — Bacteroides nodosus, клетки которого грамотрицательные, размером 1,7x3-6 мкм, нередко с утолще ниями на одном или обоих концах, располагаются единично или парами; Bacteroides melaninogenicus имеет форму грамотрицательных палочек (0,5-0,8x0,9-2,5 мкм), иногда в виде коротких нитей; Bacteroides fragilis и Bacteroides levii имеют форму грамотрицательных палочек размером 0,6 -1,3x1,6-8 мкм, располагающихся единично, парами. Таким образом, в окрашенных препаратах из контаминированного материала могут присут­ствовать сходные по морфологии и тинкториальным свойствам бактери­альные клетки. Клетки F.necrophorum имеют определенное сходство не только с фузобактериями и бактероидами, но и с клетками некоторых грамположительных бактерий родов Eubacterium и Clostridium, которые при окраске по Граму легко обесцвечиваются.

Выделение и идентификация культуры возбудителя

Культивирование. Возбудитель — строгий анаэроб, оптимальное разрежение — 4 -10 мм ртутного столба, температурный оптимум 36-37° С, рН 7,4-7,6, лучше растет на средах с добавлением крови, сыворотки крови, глюкозы, лактозы, дрожжевого экстракта.

Первичные посевы обычно производят на плотные питательные среды с последующей отвивкой культур на жидкие среды. Из жидких сред посев материала проводят на среду Кита-Тароцци, мартеновский бульон, луч­ше с добавлением 10% стерильной крови барана или крупного рогатого скота, а также 0,4% глюкозы. Используют тиогликолатный бульон с К-геминовой добавкой. Посев на жидкие среды целесообразно проводить при малом содержании возбудителя в исследуемом материале, с последующим высевом культуры на плотные среды. Для лучшего роста в жидкие пита­тельные среды добавляют 0,4% глюкозы и витаминную К-геминовую до­бавку, сыворотку крови. Перед использованием среды обязательно выдер­живают в течение 20-30 минут в кипящей водяной бане и охлаждают до 37-38° С. По данным Я.Р.Коваленко, F.necrophorum растет в стерильной сыворотке крови. Из полужидких сред может быть использован ПЖА по Муромцеву с добавлением 5-10% сыворотки крови, 2% глюкозы, 0,2% цистина.

В качестве плотных сред для первичной изоляции возбудителя применя­ют глюкозный (1%), сывороточный (10-20%) агар, глюкозо-кровяной агар. Агаровые среды готовят непосредственно перед посевом или выдержива­ют перед использованием в течение 6-24 часов в анаэробных сосудах. С целью стимуляции роста возбудителя рекомендуется добавлять дрожжевой экстракт, витамин К и гемин. Для создания условий анаэробиоза использу­ют общепринятые методы: культивирование на жидких средах под слоем вазелинового или парафинового масла, добавление в среды редуцирую­щих веществ, на плотных средах в анаэростатах с удалением воздуха при помощи вакуумного насоса до необходимой степени разрежения или заме­ной воздуха газовой смесью (Н₂ - 10%, СО₂ - 5%, N₂ — 85%) либо с ис­пользованием газ-пакетов (см. «Культивирование анаэро­бов»).

При исследовании загрязненного посторонней микрофлорой материа­ла рекомендуют для подавления протея добавлять к агару 5,5-6% этанола (95%) перед его разливом в чашки Петри. На такой среде протей теряет способность к ползучему росту и образует округлые, выпуклые, с ровными краями колонии. Культивирование посевов проводят при 36-37° С в течение 5-7 суток, с ежедневным про­смотром.

На сывороточно-глюкозном агаре через 48-72 часа инкубирования воз­будитель формирует очень мелкие росинчатые колонии диаметром до 1 мм, которые через 4-5 суток достигают диаметра 2-3 мм. Колонии округлые или продолговатые, с гладкой блестящей поверхностью, ровными или слег­ка зазубренными краями, в центре небольшое углубление, структура мелко­зернистая, цвет серовато-белый или зеленоватый до желтоватого. При выра­щивании на кровяных агаровых средах (кровь кролика) гемолитическая ак­тивность варьирует, гемолиз типа β или а. Колонии легко снимаются с по­верхности среды и эмульгируются в физиологическом растворе. При культи­вировании на желточном агаре большинство штаммов проявляют липазную, но не лецитиназную активность. При посеве методом заливок в глубине глю-козного агара на 4-5-е сутки образются небольшие чечевицеобразные серо­вато-белые колонии. Величина и форма колоний зависят от плотности агара. В сывороточном агаре через 2-3 суток формируются непрозрачные четко контурированные колонии с видимыми под малым увеличением микроскопа отходящими нитями.

На полужидком печеночном агаре (0,15%) через 24-72 часа инкубиро­вания возбудитель растет в виде облачка с интенсивным помутнением сре­ды и заметным газообразованием. На мозговой среде возбудитель растет хорошо, после добавления к среде раствора сернокислого железа происхо­дит ее почернение ввиду выделения возбудителем сероводорода. В среде Кита-Тароцци рост наблюдается через 15-48 часов инкубирования в нижних слоях питательной среды, позднее — в верхних. Через 9- 10 часов среда просветляется, на кусочках печени фор­мируется ватообразный налет, разбивающийся при встряхивании в равно­мерную взвесь. Слабое газообразование отмечается только на ранней ста­дии роста культуры. Для улучшения роста возбудителя в среду добавляют 10% крови или сыворотки крови крупного рогатого скота или барана. В стерильной сыворотке крови F.necrophorum через 24-48 часов инкубиро­вания растет в виде сероватых нитевидных хлопьев по всему столбику сре­ды, с последующим формированием осадка.

Морфология клеток F.necrophorum в культуре

В первичных культурах, в печеночном бульонe с добавлением сыворот­ки крови клетки имеют форму нитей с утолщениями, без разветвлений, дли­ной 10-100 мкм и шириной 0,5-0,7 мкм. В старых бульонных культурах и агаровых преобладают палочки длиной 1,8-2 мкм, шириной 0,5-0,7 мкм. Характерным является неравномерное зернистое окрашивание кле­ток возбудителя, что хорошо проявляется при фиксации мазков спирт-эфи­ром и окрашиванием в течение 2-3 секунд фуксином Циля, метиленовым Синим Леффлера или фуксином-синькой по Муромцеву. F. necrophorum спор, капсул и жгутиков не образует.

Идентификация F.necrophorum по ферментативным признакам. При изучении ферментативной активности у выделенной чистой культуры определяют способность гидролизовать гшшурат, эскулин, образовывать ин­дол, сероводород, кислоту из углеводов. Для возбудителя некробактериоза характерно: отсутствие способности к гидролизу гиппурата, эскулина, обра­зованию кислоты из галактозы, маннозы, целлобиозы, мелибиозы, сахарозы, трегалозы, раффинозы, салицина; возбудитель непостоянно расщепляет глю­козу, дает кислотообразование на среде с фруктозой, сахарозой, мальтозой. Огдельные штаммы могут ферментировать маннит, дульцит, глицерин; не рас­щепляет желатину и свернутую сыворотку, не редуцирует нитраты, образует индол и сероводород. Критерии дифференциации F.necrophorum от сходных фузобактерий представлены в таблице 84. При изучении ферментативной активности фузобактерий могут быть использованы коммерческие анаэроб­ные идентификационные системы (API 20A, API - LYM, ATB 32A, Minitek anaerobic 11). Вид F.necrophorum неоднороден по биологическим свойствам, что позволяет выделить в нем 4 биотипа (таблица 87 ).

Биопроба

Проводят с целью выделения чистой культуры возбудителя и проверки патогенных свойств. Выделение чистой культуры возбудителя, ввиду час­той контаминации материала сопутствующей микрофлорой, путем посева на питательные среды не всегда успешно. Поэтому изоляция возбудителя с использованием биопробы имеет существенное диагностическое значение. Из лабораторных животных чувствительны кролики и белые мыши. Наи­более удобной лабораторной моделью является кролик. Биопробу прово­дят одновременно с посевом материала на питательные среды. Исследуе­мый материал растирают в физиологическом растворе (1:10) и вводят кро­ликам в дозе 0,5-1 мл подкожно в область средней трети наружной повер­хности уха или внутрикожно в область живота. Белым мышам материал вводят в дозе 0,2-0,4 мл подкожно у основания хвоста. В случае необхо­димости аналогичным образом животных заражают выделенной культу­рой. Наблюдение за животными осуществляют в течение 10 суток. В положительных случаях на месте инъекции через 3-4 дня или позднее развива­ется воспалительный процесс с некрозом кожи.

Таблица 87 - Дифференциальные признаки видов

рода Fusobacterium

Признаки	F.necrophorum	F.necrogenes	F.russii	F.simiae	F.gonidioformans	F.pseudonecrophorum
Гидролиз гиппурата	-	-	-/+	+	V	н.д.
Гидролиз эскулина	-	+	-	-	-	-
Рост в среде с желчью (20% КРС)	-/+	-/+	-	+	-	+
Образование индола	+	-	-	+	+	+
Образование H2S	+	+	-/+	+	+	+
Гемолиз	β/а	β/-	-/β	-	a/-	_
Образование кислоты из: Глюкозы	-/w	w/+	-	+	-	w
Галактозы	-	н.д.	-	-	-	-_
Маннозы	-	w/+	-	-	-	-
Фруктозы	w/+	w/+	-	+	-	w
Целлобиозы	-	-/w	-	-	-_	-_
Мелибиозы	-	-/w	-	-	-	-
Сахарозы	-	-/w	-	-	-	-__
Трегалозы	-	w/-	-	-	-	-
Рафинозы	-	-/w	-	-	-	-_
Салицина	-	-/w	-	-	-	-

Примечание: w— слабая реакция; н.д. — нет данных;v— варьирующая реакция.

У кроликов при заражении в кожу живота процесс распространяется на подкожную клетчатку, брюшные мышцы, развивается перитонит. При ге­нерализации процесса некротические очаги возникают в печени, сердце, легких и других органах. При заражении под кожу уха на месте инъекции формируется язва, затем наступает парез уха и некроз кожи головы. При заражении слабовирулентными штаммами процесс развивается медленнее и некротические очаги обнаруживаются во внутренних органах.

Таблица 88 - Свойства биотипов F.necrophorum (Fiеvеr, 1963)

Признаки	А	Биотип АВ	В	С
Агглютинация куриных эритроцитов	+	+ /-	-	-
Гемолизин	+	+	+	-
Оседание в жидкой питательной среде	-	+ /-	+	-
Патогенность для мышей суточной буль­онной культуры	+ + +	+ +	+	-

У зараженных мышей некротический процесс локализуется в коже у корня хвоста, захватывает глубокие ткани. Мыши обычно погибают через 6-10 дней после заражения.

При обнаружении некротических очагов материал берут на границе здо­ровой и пораженной ткани для микроскопического исследования и посева на питательные среды. Рекомендуется брать для выделения чистой культу­ры возбудителя у кролика на последней стадии заболевания кровь из серд­ца (2 мл) и высевать на сывороточный (10%) агар (рН 7,0) методом заливок. Из выросших колоний культуру возбудителя отвивают на жидкие пита­тельные среды (10%-ный сывороточный бульон).

От павших или убитых на 4-5-е сутки зараженных животных, по­мимо некротических кожных поражений исследуют материал из оча­гов во внутренних органах. В этом случае вероятность выделения чис­той культуры выше.

Лабораторная диагностика копытной гнили овец и коз

Копытная гниль — инфекционная, хронически протекающая контаги­озная болезнь овец и коз, характеризующаяся мацерацией и воспалением кожи свода межкопытной щели, прогрессирующим гнойно-некротическим распадом копытного рога и хромотой.

Возбудитель — анаэробная, грамотрицательная, неспорообразую-щая палочковидная бактерия Bacteroides nodosus, рода Bacteroides, семейства Bacteroidaceae. Род Bacteroides содержит более сорока видов, часть из которых наряду с B.nodosus могут быть выделены из Клинических материалов от животных. Лабораторная диагностика копытной гнили основана на результатах бактериологического ис­следования

Бактериологическое исследование

Для микроскопического исследования готовят мазки-отпечатки из свежепораженных участков основы кожи копытец и слизи, покрывающей кожу межпальцевых щелей. Для биопробы материал берут из различных участ­ков копытец и используют для постановки биопробы немедленно.

Для выделения культуры возбудителя и транспортировки жидкий мате­риал отсасывают в стерильные шприцы, удаляют из них воздух, иглы сги­бают. Посмертно отбирают кусочки свежепораженной ткани размером 2 см³. Материал можно также собирать стерильными тампонами, свободными от кислорода, стерилизованными во флаконах, заполненных азотом. Проце­дуру взятия материала такими тампонами проводят максимально быстро и затем тампон глубоко погружают в транспортную среду Cary-Blair. Ку­сочки тканей, шприцы с материалом помещают в специальные анаэробные контейнеры, пластиковые термостабильные контейнеры с газогенерирующим содержимым и индикатором анаэробных условий. Исследуемый мате­риал хранят (транспортируют) при температуре выше 4-6° С. Все виды материалов необходимо исследовать в течение пяти часов.