Серологическая диагностика

Для выявления секреторных антител при генитальном кампилобактериозе крупного рогатого скота применяют реакцию агглютинации с влагалищ­ной слизью (РАВС).

Техника постановкиа РАВС. Используют кампилобактериозный анти­ген биофабричного производства (C.fetus subsp. venerealis), который разво­дят 3%-ным раствором NaCI с 0,3% формалина до концентрации 1 млрд.м.к./мл (1:10). Тампон с вагинальной слизью выдерживают в бактериологичес­кой пробирке с 5 мл стерильного раствора NaCI (3%) в течение 12-14 часов при 4°С. Тампон отжимают, жидкость центрифугируют при 3000 об/мин 30 минут. Надосадочную жидкость исследуют в следующих разведениях: неразведенный экстракт, 1:2, 1:4, 1:8. Средой разведения служит 3%-ный ра­створ NaCI. К 0,5 мл каждого разведения исследуемого экстракта добавля­ют 0,5 мл взвеси антигена. Контролями служат: антиген (0,5 мл) + 0,3%-ный раствор NaCI (0,5 мл); разведения диагностической агглютинирующей сы­воротки против C.fetus subsp. venerealis (1:50-1:400) + 0,5 мл антигена; раз­ведение нормальной кроличьей сыворотки (1:100,1:200) + 0,5 мл антигена. Опытные и контрольные пробирки после встряхивания помещают в термо­стат на 24 часа при 37° С. Через 3-6 часов выдерживания компонентов при комнатной температура учитывают результат по общепринятым для РА кри­териям. Положительным результатом считается наличие РА на + + +, + + + + креста во всех или в первой и второй пробирках. Как сомнительный резуль­тат оценивают наличие РА на (+ +) или (+) крест в первой и второй пробир­ках. Отрицательный результат: отсутствие агглютинации во всех пробир­ках. У овец серологическую диагностику проводят при помощи пробироч­ной РА. Сыворотку крови исследуют в разведениях 1:100,1:200 и 1:400. Как положительный результат оценивают РА на четыре-три креста в разведении 1:200, сомнительный — на четыре-три креста в разведении 1:100 или на два-один крест в разведении 1:200. Сыворотки крови от вакцинированных жи­вотных не исследуют.

Питательные среды

Транспортная среда Кери-Блер. Тиогликолат натрия — 1,5 г; фосфат натрия двузамещенный — 1,1 г; хлорид натрия — 5 г; агар 1,6 г; дистиллированная вода — 991 мл. Уста­навливают рН среды 8,4, стерилизуют текучим паром 4 мин.

Транспортная среда для C.fetus. Свежая сыворотка крови крупного рогатого скота с содержанием в 1 мл: 5-флуорацил — 300 мг; полимиксин В сульфат — 100 ЕД; бриллиантовый зеленый — 50 мкг; налидиксовая кислота — 3 мкг; циклогексимид — 100 мкг.

Смесь разливают в 30 мл флаконы по 10 мл, закрывают резиновой проб­кой, помещают на 2 минуты в кипящую водяную баню для затвердевания. После охлаждения среду перемешивают стеклянной палочкой, прокалыва­ют пробку иглой, переносят флакончики в емкость, содержащую 2,5% 0₂, 10% С0₂,87,5% N₂. Иглу удаляют после помещения флакона в сосуд. Среду хранят при 4°С, используют не ранее чем через неделю в течение 3 месяцев.

Среда Скирроу для выделения C.fetus. Состав: кровяной агар № 2 (Oxoid CM 271) — 1000 мл; лизированная дефибринированная овечья кровь — 50 мл; ванкомицин —10 мг; полимик­син В —2500 ЕД; триметоприм — 5 мг. Автоклавированныи кровяной агар охлаждают до 5° С, добавляют другие компоненты. Селективная добавка Скирроу (ванкомицин, полимиксин В, триметоприм) в указанных пропор­циях может быть внесена в другую подходящую как основу среду.

Жидкая обогатительная среда. Состав: питательный бульон № 2 — 25 г; дистиллированная вода — 1000 мл; лизированная кровь лошади — 70 мл; ванкомицин — 10 мг; поли­миксин В — 2500 ME; триметоприм — 25 мг.

Модифицированная обогатительная среда Престон. Состав: питательный бульон № 2— 25 г; дистиллированная вода — 1000 мл; лизированная кровь лошади — 50 мл; полимиксин В — 5000 ME; триметоприм —10 мг; рифампицин —10 мг; циклогексимид —100 мг; суль­фат железа — 0,025%; метабисульфит натрия — 0,025%; пируват натрия — 0,025%.

Сафранин-железо-новобиоционовая среда. Приготовление экстракта мышцы сердца. Сердце крупного рогатого скота освобождают от жира, пленок, клапанов и пропускают через мясо­рубку. 1 кг фарша настаивают в 2 л водопроводной воды в течение 24 часов. Затем кипятят в течение 1 часа, после чего доливают дистиллиро­ванную воду до первоначального объема. Фильтруют среду через бумаж­ный фильтр, разливают по колбам и стерилизуют при 1 атм 30-40 минут.

Приготовление печеночной воды. Свежую печень крупного рогатого ско­та освобождают от жира, канальцев и режут на небольшие кусочки. 1 кг печени кипятят в 1 л водопроводной воды в течение 1 часа. После чего доливают дистиллированную воду до первоначального объема. Фильтру­ют через бумажный фильтр, разливают по колбам и стерилизуют при 1 атм 30-40 минут.

Приготовление полужидкого агара. Берут 250 мл экстракта из мышцы сердца, 250 мл печеночной воды и 500 мл дистиллированной воды. К этой смеси добавляют 10 г пептона, 5 г поваренной соли и кипятят 15 минут, доводят до первоначального объема дистиллированной водой, устанавли­вают рН 7,1-7,2, добавляют 1,5-2 г агар-агара и кипятят 15 минут до полного растворения агар-агара.

Приготовление среды. Предварительно в отдельных темных флаконах готовят следующие водные (на дистиллированной воде) раство­ры: 2%-ный раствор сернокислого закисного железа (FeS0₄ x7H₂0); 0,5%-ный раствор сафранина Т; 0,2%-ный раствор новобиоцина (при наличии новобиоцина в таблетках одну таблетку, содержащую 125 тыс. ЕД, ра­створяют в 62,5 мл дистиллированной воды, что соответствует 0,2%-ному раствору). Указанные растворы можно хранить в холодильнике (при 4°С) в течение месяца. К 985 мл полужидкого агара добавляют 5 мл 2%-ного ра­створа сернокислого железа, 5 мл 0,5%-ного раствора сафранина Т и 5 мл 0,2%-ного раствора новобиоцина, тщательно перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр. Среду разливают в пробирки по 5 мл и стерилизу­ют при 0,8 атм 25 минут. После стерилизации рН среды равен 6,8, цвет розовый. Пробирки со средой хранят при комнатной температуре (не выше 25°С), в темном месте в полиэтиленовых пакетах. При этих условиях среда пригодна для употребления в течение месяца.

Плотная среда ВИЭВ. Приготовление компонентов среды. Отвар из мозга крупного рогатого скота. Свежий мозг крупного рогатого скота освобождают от оболочек, пленок и измельчают на мясорубке. К 1 кг фарша добавляют 1 л водопро­водной воды, настаивают в течение 18-24 часов, затем кипятят в течение 1 часа. После кипячения доливают дистиллированной воды до первона­чального объема, фильтруют через 2 слоя марли, разливают по колбам и стерилизуют при 1 атм в течение 30-40 минут.

В отдельных темных флаконах готовят на дистиллированной воде 0,5%-ный раствор сафранина Т и 0,2%-ный раствор новобиоцина. Растворы год­ны для применения в течение 1 месяца, при условии хранения в холодильни­ке при 4-6° С.

Приготовление среды. Смешивают 745 мл сердечного (см. выше) и 245 мл мозгового отвара. К полученной смеси добавляют 10 г пептона, 5 г поваренной соли, 20 г агар-агара, 1 г цистеина, по 5 мл приготовленных растворов сафранина Т (25 мкг/мл) и новобиоцина (10 мкг/мл). Среду разливают во флаконы и стерилизуют при 0,8 атм в течение 25 минут. После автоклавирования рН среды 6,8-7,0. В таком состоянии среду хранят при комнатной температуре в течение 2 недель. Перед употреблением среду расплавляют, охлаждают до 45-50°С, добавляют в нее 10% дефибринированной крови барана или крупного рогатого скота и разливают в чашки Петри по 20 мл.

Полужидкий агар ВГНКИ с 1% глицина. В смесь, состоящую из 500 мл водопроводной, 250 мл мясной и 250 мл печеночной воды, вносят 10 г пептона, 2 г агара. Кипятят до полного раство­рения агара (15-20 минут). Устанавливают рН 7,3-7,4. Добавляют 10 г глицина, 35 г хлорида натрия, 10 мл желчи, 1-3 мл раствора бриллиан­тового зеленого 1:1000, разливают и автоклавируют при 115°С 30 минут.

Лабораторная диагностика боррелиоза птиц

Боррелиоз птиц (спирохетоз, трепонемоз) — инфекционное септическое за­болевание птиц, передающееся через укусы клещей, распространено на всех континентах. Восприимчивы куры, гуси, реже — утки, индейки и другие домашние птицы. Заражение птиц в естественных условиях происходит через укусы клещей Argas persicus, A.reflexus, A.minatus, Ornilhodorus avium. Особенно тяжело переболевает молодняк, птица становится малоподвижной, худой, развива­ется зеленоватый понос; гребень, сережки и слизистые оболочки приобрета­ют желтовато-коричневый цвет, смертность достигает 10-99%. Возбудите­лем болезни является извитая грамотрицательная бактерия — Borrelia anserina, род Borrelia. Лабораторная диагностика боррелиоза основывается на результатах бактериологического исследования.

Бактериологическое исследование. Для исследования берут кровь, печень, селезенку, желчный пузырь, яични­ки и костный мозг. Материал исследуют в кратчайшие сроки после взятия, учитывая, что в трупах птицы боррелии быстро лизируются

Микроскопическое исследование исходного материала, обнаружение антигенов возбудителя. Готовят мазки крови, взятой прижизненно из подкрыльцовой вены, гре­бешка, посмертно — из сердца; мазки — отпечатки из печени, селезенки, почек, костного мозга. Мазки окрашивают по методу Романовского (48-72 ч при комнатной температуре), метиленовым синим и др. методами, используемыми для окраски лептоспир. Применяют метод негативного окрашивания с тушью: каплю крови смешивают на предметном стекле с 1-2 каплями туши, разведенной 1:2 дистиллированной водой, препарат подсушивают и микроскопируют. На темном фоне туши видны клетки неокрашенных боррелий. Для выявления возбудителя в живом виде кап­лю материала помещают на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и просматривают в микроскопе с темнопольным конденсором — в положительных случаях на темном фоне видны серебристые, светящие­ся клетки возбудителя. Клетки B.anserina спиралевидные, с заостренны­ми концами длиной от 8 до 20 мкм, количество витков от 2 до 15с шагом витка от 0,3 до 3 мкм. Толщина клеток 0,2- 0,4 мкм. В препарате «раз­давленная капля» можно наблюдать движение клеток возбудителя: по­ступательное, вращательное, штопорообразное. Иногда боррелий обра­зуют сплетения из нескольких клеток или выпрямляются, приобретая ни­тевидную форму. Для обнаружения и идентификации клеток возбудителя, при наличии меченых антисывороток, применяют реакцию иммунофлуоресценции, для растворимых антигенов — реакцию диффузионной преци­питации. До настоящего времени микроскопическое исследование оста­ется основным методом диагностики боррелиоза птиц.

Выделение и идентификация культуры возбудителя

B.anserina — микроаэрофил, температурный оптимум 28-30° С, рН 7,3-7,5. Посевы производят из крови, печени, селезенки, желчного пузыря, яичников. Особенно эффективны посевы крови, взятой у пти­цы на стадии лихорадки. Для культивирования применяют стериль­ную сыворотку крови, яичный белок с добавлением сыворотки кро­ви, среду Терских. Для выделения культур возбудителя применяют также 7-10-дневные куриные эмбрионы, которым вводят 0,2 мл ма­териала (кровь, взвесь ткани паренхиматозных органов) в хориоалантоисную полость. В положительных случаях эмбрионы погиба­ют через 6-8 суток, у них выявляют воспалительные и дегенератив­ные изменения.

Рост возбудителя на плотных и жидких питательных средах скудный, для поддержания культур пересевы проводят с интервалом 5-8 суток. На жидких средах рост B.anserina можно подтвердить только путем микроско­пии препаратов из культуры.

Для длительного хранения штаммов боррелий используют метод глубокого замораживания в жидком азоте. С целью заморажи­вания берут свежеполученную цитратную кровь, содержащую около 6 млрд. микробных клеток в 1 мл и замораживают в жидком азоте. Бор­релий сохраняют жизнеспособность и вирулентность в течение года хранения. Боррелий можно хранить при 2-6° С в стерильной цитрированной или гепаринизорованной крови, однако в этом случае инфекционные свойства материала постепенно снижа­ются.