Выделение и идентификация хламидии

Для изоляции хламидии могут быть использованы следующие биологичес­кие системы: мыши, морские свинки, куриные эмбрионы и культуры кле­ток. В диагностических лабораториях обычно используют три первые сис­темы.

С целью деконтаминации исследуемый материал растирают в стериль­ном физиологическом растворе (1:5), содержащем тиомерсал и канамицин 1:20 000, стрептомицин — 0,5 мкг/мл, центрифугируют суспензию при 4-5 тыс. об/мин 30 минут, отсасывают верхнюю половину надосадочной жид­кости и выдерживают ее 16-18 часов при 4-6° С или 2-3 часа при ком­натной температуре. Либо поступают следующим образом: готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе (рн 7,2-7,4), центрифугируют при 2000 об/мин 15 минут, в надосадочную жидкость добавляют стрептомицин (150 мкг/мл), пенициллин (100 ЕД/мл), выдержи­вают смесь 2-4 часа при 4-6° С. Материал из тканей кишечного тракта готовят в виде 10-15%-ной суспензии, кроме пенициллина и стрептомици­на добавляют гентамицин (20 мкг/мл), нистатин (25 мкг/мл).

С целью контроля наличия бактерий других групп материал высевают на МПБ и МПА, среду Кита-Тароцци.

Заражение куриных эмбрионов. Яйца берут от кур, в рационе которых нет антибиотиков. Для зараже­ния используют 6-7-дневные куриные эмбрионы. Скорлупу в зоне пуги дезинфицируют (70% этанол, 2% йод), прокалывают зондом. С помощью шприца 0,2-0,3 мл суспензии вводят в желточный мешок на глубину око­ло 3 см. Отверстие заливают парафином. Заражают не менее 4-6 эмбрио­нов. Контроль за жизнеспособностью эмбрионов осуществляют методом овоскопии. Гибель эмбрионов в первые трое суток инкубирования считают неспецифической. В первом пассаже специфическая гибель обычно насту­пает на 8-11-е, а в последующих — на 6-8-е сутки инкубирования эмбри­онов. Погибшие эмбри оны исследуют: после вскрытия скорлупы и оболочки воздушной камеры, захватывают стерильным пинцетом желточный мешок в области пупочно­го канатика, помещают в стерильную чашку Петри; оболочку отмывают от желтка стерильным физиологическим раствором, кусочком оболочки желточного мешка делают тонкие мазки на предметных стеклах, которые окрашивают одним из методов для обнаружения хламидий. Хламидии раз­множаются только в ткани желточного мешка.

При отсутствии специфической гибели на 12-е сутки зараженные эмбри­оны вскрывают, из желточных мешков готовят 10% суспензию, центрифу­гируют и центрифугатом заражают новую партию куриных эмбрионов. При получении отрицательных результатов (отсутствие специфической гибели) проводят до трех последовательных слепых пассажей.

В случае необходимости адаптированные штаммы хламидий можно культивировать на хориоаллантоисной оболочке (ХАО) и в аллантоис-ной жидкости. С целью пассирования в аллантоисной жидкости материал в дозе 0,3-0,4 мл вводят в аллантоисную полость 8-9-дневных кури­ных эмбрионов. Для заражения на хориоаллантоисную оболочку исполь­зуют 10-12-дневные куриные эмбрионы. В положительных случаях на 3-6-е сутки на ХАО формируются узелки, состоящие из элементарных телец хламидий.

Заражение в полость аллантоиса. Над воздушной камерой скальпе­лем прокалывают продезинфицированную скорлупу. Шприцом, на 2- 3 мм ниже границы воздушной камеры, вводят 0,3-0,4 мл исследуемого мате­риала. Отверстие в скорлупе заливают парафином.

Заражение на хориоаллантоисную оболочку. Скорлупу дезинфицируют и обрезают ножницами вокруг над воздушным пространством, пинцетом осто­рожно снимают небольшой кусочек подскорлуповой оболочки. На видимый участок хориоаллантоисной оболочки наносят материал, отверстие в скорлу­пе закрывают стеклянным колпачком и его края заливают парафином.

Наличие хламидий устанавливают исследованием мазков из оболочек желточных мешков эмбрионов, павших на 4-12-й день после заражения, в любом из трех последовательных пассажей методом МФА, ПЦР, а также окраской одним из вышеперечисленных методов.

Заражение лабораторных животных. Действующей инструкцией по диагностике хламидиозов предусматри­вается внутрибрюшинное и интраторакальное заражение белых мышей и морских свинок.

Белые мыши. Используют животных массой 16-20 г. Мыши чувстви­тельны к внутрибрюшинному, интраназальному, торакальному и внутримозговому способам заражения животных. При отсутствии гибели живот­ных на 10-е сутки после заражения убивают, из паренхиматозных органов готовят центрифугат 10% суспензии и проводят заражение очередной груп­пы животных. В целом проводят три и более «слепых» пассажей.

Внутрибрюшинно материал вводят в дозе 0,1-0,3 мл. В зависимости от степени вирулентности штамма хламидий животные заболевают и погибают на 5-10-е сутки. На вскрытии в положительных случаях в брюшной полос­ти находят скопление серозно-фибринозного экссудата, небольшое увеличе­ние селезенки и печени. Из этих органов делают мазки-отпечатки и подвер­гают исследованию с целью обнаружения и идентификации хламидий.

Интраназально материал вводят в дозе около 0,05 мл в каждую ноздрю мышам (масса —12-16 г), находящимся под легким эфирным наркозом. Проводят до 3-6 «слепых» пассажей. Для заражения используют легоч­ную ткань. Адаптированные штаммы вызывают гибель мышей на 4-6-е сутки. У погибших животных находят очаговую или лобарную пневмо­нию. Мазки-отпечатки для легочного исследования готовят из поражен­ных участков легких. В положительных случаях находят локализованные внутри- и внеклеточно элементарные тельца хламидий.

Внутримозговое заражение. Используют молодых мышей массой 5- 6 г. Удаляют (выщипывают) шерсть на голове, дезинфицируют кожу 3% раствором йода, трепаном делают небольшой прокол черепа в теменной области. Материал вводят при помощи шприца. Проводят до 5 «слепых» пассажей, адаптация хламидий наступает с 3-4 пассажей. В этом случае мыши погибают на 3-5-е сутки.

Интраторакальное заражение. Материал вводят мышам в объеме 0,3 мл через межреберные ткани с правой стороны.

Морские свинки. Используют животных массой 250-300 г. До зараже­ния пункцией сердца берут кровь для серологического исследования. Мор­ские свинки наиболее чувствительны к внутрибрюшинному и интратора-кальному заражению. Материал вводят в объеме 0,5 мл. Симптомы болез­ни проявляются через 1-3 недели, наблюдается повышение температуры тела до 40-41° С. Погибает 80-100% зараженных животных, на вскры­тии находят наложения фибрина на печени и селезенке. При отсутствии ги­бели целесообразно повторно взять пробы крови и провести исследования в РСК парных сывороток. Нарастание титра антител является достаточ­ным основанием для постановки диагноза на хламидиоз, т.к. могут встре­чаться штаммы, не вызывающие гибели животных. При заражении куриных эмбрионов и любого вида лабораторных жи­вотных обнаружение и идентификацию хламидий в препаратах из органов и тканей биологических моделей проводят микроскопическим исследова­нием окрашенных тем или иным способом мазков-отпечатков, а также ме­тодом флуоресцирующих антител, иммуноферментным и при помощи ПЦР.

Выделение хламидий на культуре клеток. Готовят раствор циклогексимида на изолирующей среде концентраци­ей 2 мкг/мл. Изолирующей средой называют среду с антибиотиками для заражения клеток исследуемым материалом: среда «Игла без глютами­на» — 400 мл, 3%-ный раствор глютамина — 5 мл, фетальная сыворотка теленка — 8% (от общего объема), гентамицин — 40 мкг/мл, 10%-ный ра­створ глюкозы — 5 мл.

В качестве ростовой среды применяют среду «Игла без глютамина» — 400 мл, 3%-ный раствор глютамина — 5 мл, фетальная сыворотка телен­ка — 4% (от общего объема), гентамицин — 40 мкг/мл.

В стерильные плоскодонные пробирки с покровными стеклами вносят по 2 мл клеточной суспензии, инкубируют 24 часа при 37° С.

В пенициллиновые флаконы с исследуемым материалом в транспортной среде (2 мл) добавляют 2 мл свежеприготовленной изолирующей среды (при интенсивном встряхивании).

Из пробирок с монослоем клеток осторожно удаляют ростовую среду и заменяют ее изолирующей средой с исследуемым материалом (по 2 мл в две плоскодонные пробирки). Центрифугируют 60 минут при 3000 об/мин в центрифуге с горизонтальным ротором. Инкубируют 2 часа при 37° С. Уда­ляют изолирующую среду, вносят по 2 мл свежей изолирующей среды с циклогексимидом. Инкубируют материал 48-72 часа при 37° С.

Удаляют среду из пробирок, не нарушая монослоя, добавляют 1-2 мл метанола (по стенке пробирки), фиксируют 10 минут, осторожно встряхи­вают пробирки для ресуспензирования белкового осадка. Промывают фос­фатным буфером (рН 6,8). В каждую пробирку вносят по 1 мл краски Романовского-Гимза на фосфатном буфере (1:9), через 30-60 минут краску уда­ляют, обработывают препарат 30% метанолом на фосфатном буфере. По­кровные стекла высушивают, размещают в канадском бальзаме (моносло­ем вниз) на предметном стекле.

Микроскопию препарата проводят в темнопольном микроскопе (х400-х600), включения хламидий дают желто-зеленую флуоресценцию. В сомни­тельных случаях исследуют препарат в обычном световом микроскопе с объективом х90.

Микроскопическая картина: элементарные тельца имеют розовый цвет, ретикулярные—синий. Данный метод исследований является трудоемким, но чувствительным.