Определение потребности в холестерине. От стерола не зависят ахолеплазмы, требуют его для своего роста микоплазмы, уреаплазмы и спироплазмы.

Прямое определение потребности микоплазм в холестерине проводится следующим образом. Бульонную культуру микоплазм логарифмической ста­дии роста центрифугируют при 20 тыс. g в течение 20 минут. Осадок отмыва­ют фосфатным буферным раствором (0,1М, рН 7,4). Взвесь микоплазм засева­ют на питательную жидкую среду без холестерина (1 мл взвеси на 9 мл среды) и 0,1 мл взвеси — на аналогичную агаровую среду. Посевы инкубируют и затем проводят пять пассажей на аналогичных средах. Ахолеоплазмы удается пассировать, микоплазмы и спироплазмы погибают через 1-2 пассажа.

Определение чувствительности к дигитонину. Исследуемую культуру разводят до 10 КОЕ/мл, 0,2 мл культуры засе­вают в виде стекающей капли на плотную оптимальную питательную сре­ду, содержащую 10-20% сыворотки крови. Затем, после подсушивания в течение 10 минут, на зону посева помещают стерильный диск фильтроваль­ной бумаги, пропитанный раствором дигитонина. Посев инкубируют в течение времени, необходимого для роста микоплазм, и измеряют зону задержки роста вокруг дисков. Представители семейства Mycoplasmataceae и Spiroplasmataceae растут не ближе 2-15 мм от диска. Рост ахолеплазм не ингибируется вообще, или зона задержки роста не более 1-1,5 мм. Приго­товление дисков с дигитонином. Готовят 1,5%-ный раствор дигитонина в 95%-ном этаноле при подогревании в водяной бане. На диск из стерильной фильтровальной бумаги диаметром 6 мм наносят по 0,025 мл раствора дигитонина. Диски высушивают при 37°С и хранят при 4°С.

Определение гемагглютинирующей активности. Бульонную культуру микоплазм троекратно отмывают фосфатным бу­ферным раствором (0,1 М, рН 7,4) с 0,3 М фтористого натрия. В восемь про­бирок (лунок планшета) вносят по 0,1 мл фосфатного буфера. В первую лунку добавляют 0,1 мл суспензии микоплазм и готовят последовательные дву­кратные разведения до 1:256. Затем в каждую пробирку вносят 0,1 мл взвеси эритроцитов (1%). В контрольную пробирку вносят все компоненты, но вме­сто микоплазм — аналогичный объем буферного раствора.

Определение гемолитической активности. Исследуемую культуру выращивают на плотной питательной среде и заливают агаровой средой с эритроцитами. Чашки Петри заклеивают и инкубируют при 37° С трое суток с ежедневным контролем. Положитель­ный результат: гемолиз вокруг колоний микоплазм. Используют эритроци­ты различных видов животных. Гемолиз может быть а- и β-типа.

Приготовление агаровой среды с эритроцитами.Эритроциты троекратно отмывают в фосфатном буферном растворе. Готовят 20%>-ную взвесь, готовят 3,5%-ную основу агаровой среды, разливают по 2 мл в пробирки, автокла-вируют, охлаждают до 50° С, вносят в пробирку 0,8 мл взвеси эритроцитов, перемешивают и используют.

Разжижение сыворотки. В качестве субстрата используют питательную среду следующего со­става: 16 мл сердечного экстракта, автоклавированного при 121°С в тече­ние 20 минут, 60 мл сыворотки крови лошади, 1,6 мл 25% дрожжевого эк­стракта, 2,4 мл стерильной воды (рН 7,8). Среду разливают по 2 мл в про­бирки, подсушивают под вакуумом 20-30 минут, прогревают в скошен­ном положении текучим паром в течение 45 минут. В пробирки со средой вносят различные разведения исследуемой культуры и параллельно конт­рольной культуры, обладающей протеолитической активностью. Посевы инкубируют в течение 14—20 суток, просматривая каждые 2 дня. Положи­тельный результат: появление на поверхности свернутой сыворотки про­светлений, углублений, отверстий,полостей, небольшого количества жид­кости.

Гидролиз казеина. Приготовление питательной среды. В 120 мл воды растворяют 2 г агара (Оксоид). Устанавливают рН 7,6, автоклавируют 15 минут при 121°С. Параллельно в 90 мл воды растворяют 8 г порошка снятого моло­ка («Дифко»), устанавливают рН 7,6, автоклавируют при 121°С в тече­ние 15 минут. Расплавляют агаровый компонент, смешивают с раство­ром молока и разливают по 2 мл в пробирки. Проведение опыта. Испыту­емую культуру выращивают на агаровой среде, молочный агар расплав­ляют в водяной бане, охлаждают и несколько капель наносят на колонии испытуемой культуры. Посевы инкубируют при 37°С в течение 14 суток, результат учитывают через каждые 48 часов. Положительный результат: просветление молочного агара над колониями микоплазм.

Разжижение желатины. Приготовление питательной среды. В 100 мл воды растворяют 2,5 г сердечного экстракта («Дифко»), 12 г желатины («Дифко»), устанавли­вают рН 7,6, разливают по пробиркам по 3 и 7 мл, автоклавируют при 121 °С в течение 10 минут, охлаждают и вносят в каждую пробирку 1 мл сыворотки крови лошади и 0,25 мл 25% дрожжевого экстракта. Прове­дение опыта. Исследуемую культуру и контрольный (положительный) штамм выращивают на агаровой среде, вырезают агаровый блок с ко­лониями и переносят в пробирку с желатиновым субстратом. Посевы инкубируют при 37° С в течение 30 суток. Результат учитывают с интер­валом 14-15 суток, предварительно охладив пробирки при 4°С. В каче­стве контроля (отрицательного) инкубируют незасеянную пробирку.

Определение уреазной активности. На поверхность колонии наносят реактив, состоящий из 10%-ной моче­вины и 0,8% MgCl₂ x 4H₂0, смешанных в равной пропорции. Колонии уреаположительных микоплазм окрашиваются в темно-коричневый, а по­зднее — черный цвет. Так же можно выявлять уреазу посевом культуры в жидкую питательную среду для уреаплазм, содержащую 1% мочевины (см. «Среда Ливингстона»). Контролем служат среды без мочевины, а также пробирки, засеянные уреазопозитивным штаммом. Посевы инкубируют при 37° С в течение 5 суток. Защелочение рН среды на 0,5 ед. по сравнению с контрольным оценивают как положительный результат.

Ферментация глюкозы. Известно несколько способов определения ферментации глюкозы. Их общим недостатком является возможное снижение рН за счет присутствующих в среде сыворотки крови и дрожжевого экстракта, причем даже у микоплазм, не ферментирующих глюкозу. Чтобы избежать ошибок, из PPLO-среды исключают дрожжевой экстракт, снижают коли­чество сыворотки до 1%, делают соответствующие контроли. Исследуе­мую культуру трижды пассажируют на основной среде для активизации. Посевы инкубируют в течение 14 дней. При учете результатов используют контроли в диапазоне рН от 8,2 до 6,0 с интервалом 0,2, при помощи кото­рых и учитывают уровень закисления рН. Различия рН в опыте и контроле на 0,5 рН расценивают как положительный результат. При проведении данного теста в качестве базовой используют следующую пита­тельную среду: PPLO-бульон — 70 мл, свежий дрожжевой экстракт (25%-ный раствор) — 10 мл, инактивированная сыворотка крови свиньи или лошади 10—20 мл, глюкоза (50%-ный раствор) — 1 мл, пенициллин (200 000 ед/мл) — 0,5 мл, феноловый красный (1%-ный раствор) — 0,4 мл. В качестве посев­ного материала берут 24-часовую бульонную культуру с хорошим ростом, которую в объеме 0,5 мл засевают в пробирку со средой, содержащей глю­козу, со средой без глюкозы. Кроме того, в качестве контролей инкубиру­ют незасеянные среды с глюкозой и без глюкозы. В процессе инкубирова­ния через 24 и 48 часов контролируют наличие роста. Если испытывается анаэробная культура, то поверхность среды заливают стерильным вазели­новым маслом. Как положительный результат принимают пожелтение сре­ды вследствие ее закисления.

Гидролиз аргинина. Базовая среда: PPLO-бульон (рН 7,0) — 70 мл, свежий дрожжевой экст­ракт (25%-ный раствор) —10 мл, инактивированная сыворотка крови сви­ньи или лошади —20 мл, L-аргинин НС1 (10%-ный раствор) — 5 мл, пени­циллин (200 000 ед/мл) — 0,5 мл, феноловый красный (1%-ный раствор) — 0,4 мл. Инокуляция питательных сред, сроки инкубирования, контроли и методы оценки изменения рН такие же, как и при изучении ферментации глюкозы. В качестве контролей используют засеянные пробирки с аргини­ном и без, незасеянные пробирки с аргинином и без него. Как положитель­ный результат оценивают покраснение среды (защелочение).

Выявление фосфатазы. Фосфатаза гидролизует фенолфталеина дифосфат в свободный фенол­фталеин, что приводит к защелочению рН до 9-10. Питательная среда: PPLO-бульон — 74 мл, агар Дифко — 08 г. Смесь автоклавируют, охлаждают до 56° С, добавляют инактивированную сыво­ротку крови свиньи или лошади — 20 мл, дрожжевой экстракт (25%-ный раствор) — 10 мл, натрия фенолфталеин дифосфат (1%-ный раствор) — 1,0 мл, пенициллин (200 000 ед/мл) — 0,2 мл. Испытуемой культурой засе­вают в двух чашках Петри 7₂ площади среды, вторая половина служит контролем. После инкубации в течение 3 и 5 дней на поверхность опытной и контрольной частей чашки Петри вносят капли 5N NaOH. Наличие по­краснения в течение 30 с расценивают как положительный результат. Для проверки качества среды используют посевы с M.bovis — положительный результат и M.arginini — отрицательный результат.

Определение способности редуцировать тетразол. Агаровую культуру заливают 4 мл смеси из ионагара и трифенилтет-разолийхлорида аа (водного раствора 2,3,5-трифенилтетразолий-хлорида и ионагара), инкубируют 4-5 часов при 35° С, результат учитывают через каждые 30 минут. Положительный результат — окрашивание колоний в крас­ный, а затем — в пурпурный цвет за счет образования формазана.

Бульонная культура. Испытуемую культуру засевают в две пробирки с бульоном, содержащим 1% трифенилтетразолийхлорида, одну из пробирок заливают парафином, культивируют 14 суток при 37° С. Параллельно ана­логичным образом поступают с двумя незасеянными пробирками (контроль). Положительный результат — красно-коричневое окрашивание среды в аэробных и анаэробных условиях (пробирка с парафином).

Серологическая идентификация микоплазм

Реакция иммунофлуоресценции. Данный метод серологической идентификации микоплазм может быть использован в различных модификациях: окраска отпечатков колоний на предметных стеклах, препаратов из бульонных культур, колоний на дис­ках мембранных фильтров, микоплазм в гистосрезах, клеточных структу­рах. Общие принципы идентификации микроорганизмов прямым и непря­мым методом иммунофлуоресценции изложены в разделе «Серологические реакции». Методика идентификации микоплазм в микроколониях на мемб­ранных фильтрах описана в разделе «Микоплазмоз свиней». Наибольшее применение получил метод иммунофлуоресцентного окрашивания колоний на плотных средах, который оценивают как более специфический, чем тес­ты ингибиции роста и метаболизма. Реакцию иммунофлуо­ресцентного окрашивания колоний на агаровой среде (эпифлуоресценция) проводят следующим образом. В чашки с агаровой средой высевают дроб­но 0,1-0,2 мл бульонной культуры, инкубируют посевы при 37° С в тече­ние 3-5 дней, вносят в чашку 2 мл буферного раствора на 30 минут, слива ют, вносят 2 мл меченой сыворотки (прямой вариант) в рабочем титре, вы­держивают при 37° С 30 минут, сливают копъюгат, трижды промывают буферным раствором, после чего просматривают колонии под люминес­центным микроскопом. Колонии, связавшие гомологичные антитела, ярко флуоресцируют. При постановке реакции в непрямом варианте на первом этапе колонии обрабатывают немеченой иммунной кроличьей сывороткой, промывают буфером, наносят антикроличью люминесцирующую сыворот­ку, инкубируют при 37° С 30 минут, сливают конъюгат, трижды промыва­ют буфером и исследуют колонии под люминесцентным микроскопом.

С целью экономии дорогостоящих компонентов реакцию рекомендуется проводить с колониями на агаровых блоках. Отбирают участок агаровой среды с изолированными колониями, вырезают блок размером 5x5 мм, наносят на предметное стекло, фиксируя его смесью парафина (65%) и вазелина (35%). На одном стекле можно помещать 6-10 блоков. Затем на каждый блок наносят каплю фосфатного буфера (рН 7,2-7,4), удаляют избыток буфера. Наносят на блок каплю немеченой кроличьей сыворотки в рабочем разведении и инкубируют 30 минут при комнатной тем­пературе во влажной камере. Отмывают препарат дважды в буферном ра­створе по 10 минут. Удаляют буфер с каждого блока и наносят на блоки антикроличью меченую сыворотку в рабочем титре, инкубируют 30 минут при комнатной температуре. Отмывают препарат двукратно, по 10 минут в буферном растворе, и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Для идентификации колоний на плотных средах рекомендует агаровые блоки помещать на предметное стекло колониями вниз. Затем стекла помещают в водяную баню с температурой 85° С до расплавления агара, при этом колонии фиксируются, затем препарат до­полнительно фиксируют 10 минут ацетоном и далее окрашивают по непря­мому варианту.

Тест ингибиции роста. Основан на ингибиции роста микоплазм специфической иммунной сы­вороткой в жидкой или плотной питательной среде (употребляют для иден­тификации на уровне вида). Требует наличия достаточно активных, моно­специфических, неконсервированных иммунных сывороток. Антисыворот­кой (0,025 мл), при проведении теста на плотных питательных средах, про­питывают диски фильтровальной бумаги диаметром 6 мм непосредственно перед использованием или хранят их в высушенном состоянии при -20° С. Для тестирования берут чистую культуру концентрацией 10^-4 -10^-5 КОЕ, которую в объеме 0,2 мл равномерно распределяют по поверхности плот­ной питательной среды. Чашки выдерживают 1 час при 22-37° С и затем на поверхности агара помещают диски с антисывороткой. Лучшие резуль­таты получают на срезах с субоптимальными концентрациями сыворотки и дрожжевого экстракта. Быстрорастущие микоплазмы дают меньшую зону задержки роста. Зону задержки роста измеряют от края диска. Зону задер­жки менее 2 мм оценивают как сомнительный результат. При проведении теста ингибиции роста в жидкой или полужидкой среде предва­рительно готовят двукратные разведения иммунной и контрольной (нор­мальной) сывороток в объеме 0,2 мл на изотоническом растворе натрия хлорида, добавляют 0,2 мл культуры микоплазм, содержащей 10²-10³ КОЕ, смесь выдерживают при комнатной температуре, добавляют к ней 1,6 мл питательной среды и инкубируют 72-96 часов. За титр принимают максимальное разведение сыворотки, ингибирующее рост.

Тест ингибиции метаболизма. Может быть проведен на базе любой реакции, отражающей фермента­тивную активность идентифицируемой микоплазмы. Условием должно быть наличие определенного фермента. В качестве субстратов обычно исполь­зуют глюкозу (1%), аргинин (0,1%), мочевину (1%), тетразолий хлорид (0,33%) в жидкой питательной среде. В готовой питательной среде готовят двукратные разведения иммунных сывороток и в пробирку с каждым раз­ведением вносят 0,1-0,2 мл исследуемой культуры микоплазм (10²-10³ КОЕ/мл). Контролем служат засеянные пробирки без антисыво­ротки. Посевы инкубируют 3-5 суток и путем сравнения опытных и конт­рольных пробирок делают заключение о специфической ингибиции антите­лами той или иной метаболической реакции.

Реакция диффузионной преципитации. Используют растворимый антиген, например полученный путем двад­цатикратного замораживания и оттаивания суспензии микоплазм. Реакцию ставят обычным способом. Готовят про­бойником лунки диаметром 3 мм на расстоянии 5 мм, в центральную лунку вносят антиген, в периферические — сыворотки. Учет результатов прово­дят через 48 часов. С гомологичной сывороткой антиген дает обычно не­сколько линий преципитации, с гетерологичными — редко одну, слабо вы­раженную.

Кроме перечисленных серологических реакций используют для иденти­фикации некоторых видов микоплазм иммуннопероксидазный тест, РСК. В последние годы с успехом апробирована для указанных целей реакция цеп­ной полимеризации. Штаммы M.gallisepticum, а также M.synoviae, M.meleagridis и других птичьих микоплазм имеют внутривидовые вариа­ции антигенных и вирулентных свойств, что может быть выявлено путем электрофореза белков в полиакриаламидном геле, гибридизацией ДНК.